基于siRNA的高通量篩選鑒定影響自噬的lncRNAs
首先，研究人員針對(duì)肺癌、肝癌或乳腺癌中638個(gè)上調(diào)的lncRNAs制備siRNA文庫(kù)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)高內(nèi)涵成像和自動(dòng)化定量分析，鑒定了63個(gè)lncRNAs轉(zhuǎn)錄本在敲低后會(huì)影響GFP-LC3B斑點(diǎn)的數(shù)量，暗示可能參與自噬的調(diào)控。然后根據(jù)基因注釋、外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和基因組位置，研究人員選取14個(gè)候選lncRNAs（6個(gè)下調(diào)，8個(gè)上調(diào)）進(jìn)行驗(yàn)證篩選，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本uc002asg.1（lncRNA DRAIC）的敲低最顯著地減少了GFP-LC3B斑點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。
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DRAIC的定位，表達(dá)和自噬非依賴性
通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析和核質(zhì)分離證實(shí)DRAIC在MCF-7細(xì)胞中是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位，并且Torin1處理誘導(dǎo)的自噬不會(huì)改變DRAIC的細(xì)胞定位。此外，研究發(fā)現(xiàn)DRAIC在乳腺癌中高表達(dá)，而自噬并不影響其表達(dá)水平，表明DRAIC是自噬非依賴性的。
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DRAIC敲低減少了自噬體數(shù)量和LC3B蛋白水平
研究人員通過(guò)透射電子顯微鏡法觀察和量化了DRAIC敲低后成熟自噬體的數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬體超微結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化，但自噬體的數(shù)量更少。GFP-LC3B斑點(diǎn)和自噬體的減少是否與較低水平的LC3B蛋白相關(guān)呢？Western blot結(jié)果顯示，DRAIC敲低使得GFP融合和內(nèi)源性LC3B (I和II)的表達(dá)均降低，但LC3B和GFP-LC3B mRNA水平保持穩(wěn)定。過(guò)表達(dá)DRAIC則明顯增加了LC3B蛋白水平。
DRAIC敲低增加了自噬潮并作用于mTOR途徑
由于自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，自噬體數(shù)量的減少和LC3B蛋白水平的降低可以說(shuō)明兩種不同的情況。要么自噬誘導(dǎo)減少，表現(xiàn)為PE結(jié)合的LC3B (LC3B-II)較少，要么自噬潮增加，以至于大部分LC3B-II被溶酶體降解。研究人員發(fā)現(xiàn)DRAIC的缺失降低了自噬受體p62的蛋白水平，而p62是一種自噬貨物，它被摻入自噬體并在自噬體中降解。因此，DRAIC敲低后導(dǎo)致的p62減少表明了自噬潮的增加。
為了進(jìn)一步研究DRAIC對(duì)自噬潮的影響，研究人員通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了ATG5和ATG7敲除的MCF-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在這些敲除細(xì)胞系中敲低DRAIC對(duì)LC3B-I的作用已基本消除，這表明DRAIC介導(dǎo)的LC3B調(diào)控需要ATG5和ATG7依賴性自噬潮。
由于mTORC1復(fù)合物是自噬途徑的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子之一，那么DRAIC是否也會(huì)影響mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)呢。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DRAIC缺失會(huì)導(dǎo)致mTOR激酶的直接靶點(diǎn)ULK1的Ser757磷酸化減少以及p70S6激酶的Thr389磷酸化水平明顯下降。
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總之，這些結(jié)果表明在缺乏DRAIC的情況下，mTORC1下游的信號(hào)傳導(dǎo)減少，自噬潮增加。
DRAIC敲低影響細(xì)胞周期進(jìn)程
研究人員除了對(duì)GFP-LC3B斑點(diǎn)進(jìn)行定量分析外，還對(duì)每個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程中的細(xì)胞活力進(jìn)行了測(cè)量，發(fā)現(xiàn)DRAIC的敲低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)下降。為了了解DRAIC對(duì)細(xì)胞活力的影響及其與自噬表型的可能聯(lián)系，研究人員對(duì)DRAIC缺失的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序。基因集富集分析發(fā)現(xiàn)在DRAIC敲低后下調(diào)的基因中，E2F靶基因和G2M檢查點(diǎn)基因富集比例最高。
流式分析顯示DRAIC缺失的細(xì)胞在G1期(76.8和83.2%)積累，S期檢測(cè)到的細(xì)胞較少。
通過(guò)western blotting進(jìn)一步分析DRAIC對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的影響，發(fā)現(xiàn)DRAIC敲低導(dǎo)致p53及其下游靶點(diǎn)p21上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白A、E2和D1減少，并且降低了Rb在S608和S795位點(diǎn)的磷酸化。表明DRAIC與細(xì)胞周期從G1期向S期過(guò)渡有關(guān)。
DRAIC以自噬非依賴性方式對(duì)細(xì)胞增殖至關(guān)重要
研究發(fā)現(xiàn)DRAIC的缺失導(dǎo)致細(xì)胞增殖率下降，而過(guò)表達(dá)DRAIC導(dǎo)致細(xì)胞增殖速度加快，證實(shí)了DRAIC與增殖有關(guān)。為了進(jìn)一步探索增殖缺陷是否與自噬有關(guān)，研究人員將ATG5和ATG7敲除細(xì)胞系中的DRAIC的敲低，并監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬缺陷細(xì)胞也表現(xiàn)出同樣的增殖缺陷。表明DRAIC以自噬非依賴性方式對(duì)細(xì)胞增殖至關(guān)重要。
總之，目前的高通量高內(nèi)涵siRNA文庫(kù)篩選為研究lncRNAs在自噬中的功能提供了有價(jià)值的資源。在此基礎(chǔ)上，本研究鑒定了lncRNA DRAIC是乳腺癌細(xì)胞自噬的一種新的調(diào)節(jié)因子。深入了解了lncRNAs與自噬之間的相互依賴關(guān)系，可能在不久的將來(lái)就可以推動(dòng)臨床治療的發(fā)展。
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原文：Tiessen I, Abildgaard M H, Lubas M, et al. A high-throughput screen identifies the long non-coding RNA DRAIC as a regulator of autophagy[J]. Oncogene, 2019, 38(26): 5127-5141.
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銳博生物高內(nèi)涵細(xì)胞成像與篩選服務(wù)-siRNA文庫(kù)篩選是在銳博生物擁有的亞洲領(lǐng)先的激光共聚焦高內(nèi)涵平臺(tái)IN Cell 6500HS平臺(tái)上，結(jié)合預(yù)制或定制型siRNA文庫(kù)，針對(duì)細(xì)胞不同階段出現(xiàn)的信號(hào)或行為，快速準(zhǔn)確篩選出科學(xué)家課題項(xiàng)目中可能感興趣的功能基因、疾病致病因子、全新靶點(diǎn)、藥物靶標(biāo)等，銳博生物提供基于高內(nèi)涵細(xì)胞表型分析與大數(shù)組宏分析的技術(shù)服務(wù)，幫助科學(xué)家們精準(zhǔn)捕獲大量樣本siRNA沉默后的高清顯微圖像、多樣化多通道的篩選或分析結(jié)果。
基于siRNA的高通量篩選流程：
1、siRNA 文庫(kù)（pooled siRNA 形式）初篩；
2、根據(jù)初篩結(jié)果挑選有效基因的siRNA（individual siRNA）進(jìn)行復(fù)篩；
3、根據(jù)復(fù)篩結(jié)果挑選效應(yīng)最強(qiáng)最穩(wěn)定的基因進(jìn)行其它功能指標(biāo)檢測(cè)。
服務(wù)優(yōu)勢(shì)：
■ 亞洲領(lǐng)先高內(nèi)涵平臺(tái)，豐富項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)和方法學(xué)策略：數(shù)千例樣本的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，上百種方法學(xué)開(kāi)發(fā)，滿足更多需求
■ 高通量自動(dòng)化：多樣本、多參數(shù)、自動(dòng)移液/洗板/CO2培養(yǎng)/分液/控制，避免人為主觀干預(yù)影響
■ 多檢測(cè)通道，結(jié)果呈現(xiàn)更豐富，更多樣化： ACUMEN eX3覆蓋405/488/633，IN Cell Analyzer 6500HS覆蓋405/488/561/642
■ 強(qiáng)大圖像捕獲能力，檢測(cè)靈敏度更高：寬場(chǎng)掃描、激光共聚焦、3D 成像、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像、無(wú)縫拼接圖像
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