摘要

本研究顯示miR-497~195簇在CD31hiEmcnhi內(nèi)皮中高表達(dá)，但在衰老過程中逐漸減少。miR-497~195缺失小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出更少的CD31hiEmcnhi血管和更低的骨量。相反，miR-497-195過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞中減輕了CD31hiEmcnhi型血管的年齡相關(guān)性減少和骨丟失。miR-497?195簇分別通過靶向Fbxw7（F-box and WD-40 domain protein）和P4HTM（Prolyl 4-hydroxylase possessing a transmembrane domain），以維持內(nèi)皮Notch活性和HIF-1α穩(wěn)定性。值得注意的是，通過靜脈注射適配子agomiR-195，內(nèi)皮細(xì)胞特異性激活miR-195，從而刺激老齡小鼠CD31hiEmcnhi血管和骨形成。研究表明miR-497?195調(diào)節(jié)血管生成和骨生成，可能代表年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶標(biāo)。

在小鼠骨骼系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了一種特異性內(nèi)皮細(xì)胞，其對(duì)CD31和內(nèi)皮粘蛋白強(qiáng)陽性。這種新的骨血管亞型命名為CD31hiEmcnhi或H型血管，能夠介導(dǎo)血管周圍骨祖細(xì)胞分化并偶聯(lián)血管生成與骨生成。衰老過程中H型內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量減少與年齡相關(guān)的骨丟失相關(guān)聯(lián)。然而，H型血管形成和退化的潛在機(jī)制仍然不清楚。由miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞調(diào)控模式之一。研究表明，miRNA在骨代謝的各個(gè)方面起著至關(guān)重要的作用。然而，miRNA在H型血管生物學(xué)調(diào)節(jié)中的作用尚不清楚。

研究背景

研究路線

1、miR-497~195簇的篩選：熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS）、miRNA微陣列、qRT-PCR、免疫染色等
2、miR-497~195簇的體內(nèi)功能研究：miR-497~195簇敲除及過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型、免疫共沉淀、流式細(xì)胞術(shù)、顯微CT掃描（μ-CT）、qRT-PCR、免疫熒光染色等
3、作用機(jī)制研究：agomiR-497~195和antagomiR-497~195、熒光素酶報(bào)告基因、Fbxw7和P4HTM siRNA、qRT-PCR、Western blot等
4、EC特異性miRNA過表達(dá)對(duì)年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松癥的治療效果：Aptamer-angomiR-195及其NC、免疫染色、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS）、顯微CT掃描（μ-CT）等

注：本研究使用到的agomiR-195及其NC由銳博生物提供。

研究結(jié)果

01 MiR-497~195簇在CD31hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)（篩選鑒定）

首先通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)挑選CD31hiEmcnhi和CD31loEmcnlo內(nèi)皮細(xì)胞；然后進(jìn)行miRNA微陣列分析，鑒定異常調(diào)節(jié)的miRNAs。發(fā)現(xiàn)miR-497~195簇在CD31hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞中具有更高的表達(dá)水平（圖1ab）。另外，人和小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-497~195水平與年齡呈負(fù)相關(guān)（圖1cd）。隨著動(dòng)物的老化，內(nèi)皮細(xì)胞中miR-497~195簇的減少與CD31hiEmcnhi血管明顯減少、Osterix+骨祖細(xì)胞顯著減少以及骨量減少相關(guān)（圖1e）。

02 MiR-497~195簇體內(nèi)功能研究

構(gòu)建miR-497~195簇敲除小鼠（miR-497~195-/-），發(fā)現(xiàn)骨/骨髓中CD31hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，Osterix+骨祖細(xì)胞和骨表面成骨細(xì)胞的數(shù)量也顯著減少（圖2a）。然而，總內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和α-SMA+動(dòng)脈分支數(shù)目沒有顯著變化。此外，骨小梁體積、數(shù)量、厚度顯著降低，而其骨小梁疏密度較高（圖2b-e）；并且骨生成率減少（圖2gh）。表明敲除miR-497~195減少了CD31hiEmcnhi血管和骨生成。相反，miR-497~195過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠則促進(jìn)了CD31hiEmcnhi血管形成和骨生成（圖3）。

03 MiR-497~195簇在內(nèi)皮細(xì)胞中維持Notch和HIF-1α活性

用agomiR-497~195或antagomiR-497~195轉(zhuǎn)染骨髓內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）以過表達(dá)或沉默miR-497~195簇。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-497~195可促進(jìn)CD31和endomucin mRNA表達(dá)，HIF-1α和NICD蛋白水平上調(diào)，而HIF-1α和Notch1的mRNA水平無變化。而抑制miR-497~195則結(jié)果相反，同樣HIF-1α和Notch1的mRNA水平無影響（圖4）。表明miR-497?195通過維持內(nèi)皮Notch和HIF-1α活性從而促進(jìn)CD31hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞的形成。

04 miR-497~195簇靶向Fbxw7和P4HTM

使用TargetScan發(fā)現(xiàn)Fbxw7和P4HTM是miR-497~195的新靶點(diǎn)。過表達(dá)或抑制miR-497~195簇改變了Fbxw7和P4HTM蛋白的內(nèi)源水平而不改變mRNA水平（圖5hi）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示AgomiR-497?195抑制了Fbxw7 3′-UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性，而MUT-pGL3-Fbxw7消除了這種抑制，P4HTM的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果類似，表明miR-497?195與Fbxw7或P4HTM的3′-UTR特異性結(jié)合（圖5jk）。Fbxw7和P4HTM siRNA轉(zhuǎn)染BMECs顯著增加NICD和HIF-1α蛋白水平（圖5l~o），表明miR-497~195通過靶向Fbxw7和P4HTM來維持Notch和HIF-1α活性。

05 注射aptamer-agomiR-195促進(jìn)CD31hiEmcnhi血管和骨生成

為了研究EC特異性miRNA過表達(dá)對(duì)年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松癥的治療效果。將aptamer-agomiR-195通過尾靜脈注射進(jìn)WT小鼠，發(fā)現(xiàn)骨/骨髓中CD31hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目顯著更高，但總內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)不變；此外，骨小梁體積、數(shù)量、厚度更高，而其骨小梁疏密度較低。aptamer-agomiR-195處理小鼠的成骨細(xì)胞和骨表面Osterix+骨祖細(xì)胞數(shù)目更高，骨小梁BFR增加并且骨強(qiáng)度增加（圖6）。表明通過靜脈注射aptamer-agomiR-195的EC特異性激活miR-195促進(jìn)了CD31hiEmcnhi血管的形成，并且刺激了老齡小鼠中的新骨形成。