摘要

本研究顯示miR-497~195簇在CD31hiEmcnhi內皮中高表達，但在衰老過程中逐漸減少。miR-497~195缺失小鼠的內皮細胞中表現出更少的CD31hiEmcnhi血管和更低的骨量。相反，miR-497-195過表達轉基因小鼠的內皮細胞中減輕了CD31hiEmcnhi型血管的年齡相關性減少和骨丟失。miR-497?195簇分別通過靶向Fbxw7（F-box and WD-40 domain protein）和P4HTM（Prolyl 4-hydroxylase possessing a transmembrane domain），以維持內皮Notch活性和HIF-1α穩定性。值得注意的是，通過靜脈注射適配子agomiR-195，內皮細胞特異性激活miR-195，從而刺激老齡小鼠CD31hiEmcnhi血管和骨形成。研究表明miR-497?195調節血管生成和骨生成，可能代表年齡相關性骨質疏松癥的潛在治療靶標。

在小鼠骨骼系統中發現了一種特異性內皮細胞，其對CD31和內皮粘蛋白強陽性。這種新的骨血管亞型命名為CD31hiEmcnhi或H型血管，能夠介導血管周圍骨祖細胞分化并偶聯血管生成與骨生成。衰老過程中H型內皮細胞的數量減少與年齡相關的骨丟失相關聯。然而，H型血管形成和退化的潛在機制仍然不清楚。由miRNA介導的轉錄后調節被認為是最重要的細胞調控模式之一。研究表明，miRNA在骨代謝的各個方面起著至關重要的作用。然而，miRNA在H型血管生物學調節中的作用尚不清楚。

研究背景

研究路線

1、miR-497~195簇的篩選：熒光激活細胞分選術（FACS）、miRNA微陣列、qRT-PCR、免疫染色等
2、miR-497~195簇的體內功能研究：miR-497~195簇敲除及過表達轉基因小鼠模型、免疫共沉淀、流式細胞術、顯微CT掃描（μ-CT）、qRT-PCR、免疫熒光染色等
3、作用機制研究：agomiR-497~195和antagomiR-497~195、熒光素酶報告基因、Fbxw7和P4HTM siRNA、qRT-PCR、Western blot等
4、EC特異性miRNA過表達對年齡相關性骨質疏松癥的治療效果：Aptamer-angomiR-195及其NC、免疫染色、熒光激活細胞分選術（FACS）、顯微CT掃描（μ-CT）等

注：本研究使用到的agomiR-195及其NC由銳博生物提供。

研究結果

01 MiR-497~195簇在CD31hiEmcnhi內皮細胞中強烈表達（篩選鑒定）

首先通過熒光激活細胞分選術挑選CD31hiEmcnhi和CD31loEmcnlo內皮細胞；然后進行miRNA微陣列分析，鑒定異常調節的miRNAs。發現miR-497~195簇在CD31hiEmcnhi內皮細胞中具有更高的表達水平（圖1ab）。另外，人和小鼠內皮細胞中的miR-497~195水平與年齡呈負相關（圖1cd）。隨著動物的老化，內皮細胞中miR-497~195簇的減少與CD31hiEmcnhi血管明顯減少、Osterix+骨祖細胞顯著減少以及骨量減少相關（圖1e）。

02 MiR-497~195簇體內功能研究

構建miR-497~195簇敲除小鼠（miR-497~195-/-），發現骨/骨髓中CD31hiEmcnhi內皮細胞數量明顯減少，Osterix+骨祖細胞和骨表面成骨細胞的數量也顯著減少（圖2a）。然而，總內皮細胞數量和α-SMA+動脈分支數目沒有顯著變化。此外，骨小梁體積、數量、厚度顯著降低，而其骨小梁疏密度較高（圖2b-e）；并且骨生成率減少（圖2gh）。表明敲除miR-497~195減少了CD31hiEmcnhi血管和骨生成。相反，miR-497~195過表達轉基因小鼠則促進了CD31hiEmcnhi血管形成和骨生成（圖3）。

03 MiR-497~195簇在內皮細胞中維持Notch和HIF-1α活性

用agomiR-497~195或antagomiR-497~195轉染骨髓內皮細胞（BMECs）以過表達或沉默miR-497~195簇。發現過表達miR-497~195可促進CD31和endomucin mRNA表達，HIF-1α和NICD蛋白水平上調，而HIF-1α和Notch1的mRNA水平無變化。而抑制miR-497~195則結果相反，同樣HIF-1α和Notch1的mRNA水平無影響（圖4）。表明miR-497?195通過維持內皮Notch和HIF-1α活性從而促進CD31hiEmcnhi內皮細胞的形成。

04 miR-497~195簇靶向Fbxw7和P4HTM

使用TargetScan發現Fbxw7和P4HTM是miR-497~195的新靶點。過表達或抑制miR-497~195簇改變了Fbxw7和P4HTM蛋白的內源水平而不改變mRNA水平（圖5hi）。熒光素酶報告基因實驗顯示AgomiR-497?195抑制了Fbxw7 3′-UTR報告基因的熒光素酶活性，而MUT-pGL3-Fbxw7消除了這種抑制，P4HTM的熒光素酶報告基因實驗結果類似，表明miR-497?195與Fbxw7或P4HTM的3′-UTR特異性結合（圖5jk）。Fbxw7和P4HTM siRNA轉染BMECs顯著增加NICD和HIF-1α蛋白水平（圖5l~o），表明miR-497~195通過靶向Fbxw7和P4HTM來維持Notch和HIF-1α活性。

05 注射aptamer-agomiR-195促進CD31hiEmcnhi血管和骨生成

為了研究EC特異性miRNA過表達對年齡相關性骨質疏松癥的治療效果。將aptamer-agomiR-195通過尾靜脈注射進WT小鼠，發現骨/骨髓中CD31hiEmcnhi內皮細胞數目顯著更高，但總內皮細胞數不變；此外，骨小梁體積、數量、厚度更高，而其骨小梁疏密度較低。aptamer-agomiR-195處理小鼠的成骨細胞和骨表面Osterix+骨祖細胞數目更高，骨小梁BFR增加并且骨強度增加（圖6）。表明通過靜脈注射aptamer-agomiR-195的EC特異性激活miR-195促進了CD31hiEmcnhi血管的形成，并且刺激了老齡小鼠中的新骨形成。