OSKM與轉錄共同調節(jié)因子之間互作誘導機制的難解之謎？

眾所周知，體細胞可以通過外源因子OSKM (OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC) 來重編程為誘導多能干細胞(iPSCs)。重編程開始時，外源性OSKM與整個基因組的DNA結合并誘導連續(xù)的染色質重組，從而激活整個多能性基因網(wǎng)絡。然而，OSKM不能單獨運作，需要共同調節(jié)因子來修飾局部表觀遺傳環(huán)境。但目前尚不清楚OSKM和不同轉錄共同調節(jié)因子（共激活因子和輔阻遏物）之間是如何相互作用或相互拮抗以誘導多能性狀態(tài)。

Miguel A. Esteban教授團隊探索了兩個已知的輔阻遏物核受體輔助抑制因子（NCoR）和視黃酸及甲狀腺激素受體沉默中介蛋白（SMRT）的功能，證明了NCoR/SMRT輔阻遏物可與多能性位點結合，從而利用4個Yamanaka因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)創(chuàng)建一個重編程障礙，發(fā)現(xiàn)抑制NCoR/SMRT就可顯著提高重新編程效率和動力學。NCoR/SMRT復合物的核心表觀遺傳亞基-組蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）可通過誘導多能性位點上的組蛋白去乙酰化而有助于NCoR/SMRT發(fā)揮作用。在Yamanaka因子中，主要由c-MYC促進NCoR/SMRT-HDAC3在基因組位點的募集。

最后，研究人員描述了c-MYC是如何對重編程的早期階段有益，而對后期階段有害。總體而言，本研究發(fā)現(xiàn)了NCoR/SMRT輔阻遏物在重編程中的作用，并在提出了c-MYC的雙重功能機制。

心臟發(fā)育是一個多步驟的過程，取決于對網(wǎng)絡的精確控制，包括多種心臟特異性轉錄因子、染色質修飾因子和信號通路。T-box轉錄因子Eomes缺失顯著損害中內胚層分化，包括心臟中胚層特化。然而，Eomes如何參與特定的心肌分化尚不清楚。先前的研究表明Eomes通過直接結合Mesp1基因的啟動子來誘導Mesp1表達。但是Eomes在心臟中胚層特化期間誘導Mesp1表達的精確調控機制仍然不清楚。

論文中的6項重要研究發(fā)現(xiàn)

1） NCoR/SMRT輔阻遏物可導致OSKM重編程障礙

通過RT–qPCR、shRNA敲降實驗及熒光素酶報告實驗等證明抑制Ncor1（編碼NCoR）和Ncor2（編碼SMRT），或者抑制NCoR/SMRT可增強OSKM重編程。

那么，NCoR和SMRT是如何阻礙重編程的呢？通過對OSKM重編程第5天和第9天的Ncor1/2缺失細胞進行RNA-seq（由銳博生物提供），發(fā)現(xiàn)Ncor1/2的敲降使得許多MEF富集的體細胞基因在第5天時被上調，在第9天時變得不明顯；而多能性相關基因在第9天時被上調（圖1）。

因此，OSKM重編程中，抑制Ncor1/2首先會導致體細胞基因抑制中的瞬時缺陷，然后導致多能性基因的加速及更有效的激活。

2） HDAC3對于NCoR/SMRT輔阻遏物損害的重編程至關重要

HDAC3作為NCoR/SMRT復合物的核心表觀遺傳亞基，負責復合物的去乙酰化酶活性。研究人員通過RNA-seq分析（由銳博生物提供）及敲降實驗發(fā)現(xiàn)Hdac3在OSKM介導的重編程中表達，且敲降Hdac3顯著增加重編程（圖2ab）。

隨后構建了HDAC3去乙酰化酶無效突變體（HDAC3-YF）、HDAC3雙突變體（HDAC3-YF-KA，與NCoR/SMRT相互作用的能力降低），發(fā)現(xiàn)HDAC3-YF能有效增強重編程，但這種增強作用在HDAC3-YF-KA突變體中消失，表明HDAC3-YF需要與NCoR/SMRT相互作用才能達到增強重編程的作用（圖2cd）。因此推斷HDAC3可介導NCoR/SMRT損害OSKM重編程，并且該功能需要去乙酰化酶活性。

3） HDAC3在多能性基因組位點誘導組蛋白去乙酰化

HDAC3是如何損害OSKM重編程呢？通過免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)OSKM重編程過程中組蛋白乙酰化水平增加，而NCoR/SMRT缺失或HDAC3-YF過表達導致其水平不再增加。然后在OSKM重編程的第5/9/13天針對H3K27ac進行ChIP–seq以驗證其對組蛋白乙酰化的影響（由銳博生物提供），發(fā)現(xiàn)大多數(shù)H3K27乙酰化（H3K27ac）位于轉錄起始位點（TSS）附近，有4個多能性位點（Sall4、Utf1、Nanog和Zic2)）在第9/13天時顯示H3K27ac的增加，此外，OSKM和HDAC3-YF重編程細胞的體細胞基因座中H3K27ac的水平略高，但只在少數(shù)情況下且僅在第5天（圖3）。表明，HDAC3作為NCoR/SMRT復合物的一部分，通過限制性位點（包括多能性位點）誘導組蛋白去乙酰化而損害OSKM重編程。

4） NCoR/SMRT在重編程中可被募集到多能性位點

NCoR/SMRT是否會被募集到多能性位點以通過HDAC3誘導組蛋白去乙酰化？研究人員對OSKM重編程第9天的serum+Vc樣本進行ChIP–seq（由銳博生物提供），發(fā)現(xiàn)很大一部分NCoR/SMRT結合峰是重編程（76%）和ESCs（56%）共有的，主要位于TSS附近（圖4ab）。進一步分析發(fā)現(xiàn)NCoR/SMRT僅在重編程過程中被募集到多能性位點Sox2和Prdm4，且這些位點具有更低水平的H3K27ac（圖4c），與NCoR/SMRT通過HDAC3損害重編程結果一致。

5） NCoR/SMRT–HDAC3通過c-MYC被募集到多能性位點

通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)c-MYC與NCoR/SMRT-HDAC3復合體之間相互作用。ChIP-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)pre-iPSCs中NCoR/SMRT與c-MYC有最強的重疊（72％的NCoR/SMRT峰），其次是KLF4（44%）和OCT4/SOX2（~5%），但大多數(shù)NCoR/SMRT與KLF4的重疊位點被c-MYC共同結合（圖5a-d）。OSKM重編程中NCoR/SMRT與OCT4、SOX2及c-MYC同樣有很強的重疊，且大部分位點都是共有的（圖5e-g）。因此，c-MYC主要幫助將NCoR/SMRT募集到基因組位點（包括多能性位點）以誘導重編程的負效應。

6） 外源性c-MYC在重編程中的雙重作用

為了進一步評估c-MYC和NCoR/SMRT在抑制多能性基因中的關系，構建了DsRed慢病毒報告基因載體（可通過多能性轉錄因子的結合直接激活），發(fā)現(xiàn)單獨的OCT4、SOX2和KLF4過表達可適當激活報告基因，它們結合后（OSK）的激活效應更強；而單獨的c-MYC沒有激活效應，結合OSK會損害報告基因活性的增加。Ncor1/2敲降部分緩解了c-MYC對報告基因的負效應（fig8bc）。研究表明通過c-MYC將NCoR/SMRT輔阻遏物募集到多能性位點是重編程的負效應力，但將c-MYC添加到OSK中又可增強重編程效率。后續(xù)實驗證明了外源性c-MYC抑制多能性位點對于通過募集NCoR/SMRT-HDAC3進行重編程的后期階段是不利的。