N6-甲基腺苷（m6A）RNA甲基化的生物學功能主要依賴于閱讀器蛋白；然而，其在肺腫瘤發生中的作用仍不清楚。近日，上海市胸科醫院王佳誼課題組在Redox Biology期刊發表了題為The m6A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function的研究論文。重點突出了：
? m6A閱讀器蛋白YTHDC2在LUAD中經常被抑制，預示著預后不良；
? YTHDC2通過其m6A閱讀結構域抑制system XC-（胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白）的抗氧化功能；
? 編碼SLC7A11的mRNA是YTHDC2的直接靶標；
? YTHDC2優先加速m6A-甲基化SLC7A11 mRNA的衰減；
? YTHDC2抑制的LUAD對system XC-抑制劑敏感。
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表明通過抑制YTHDC2促進胱氨酸的攝取對于LUAD腫瘤的發生至關重要，而阻斷這一過程可能有益于未來的治療。
研究模型示意圖
主要研究結果：
? ?YTHDC2抑制與LUAD腫瘤進展有關
為了評估m6A readers在肺癌中的表達譜，研究人員通過GEPIA和Oncomine數據庫分析LUAD中已知readers發現，YTHDC2在LUAD中普遍下調，并且較低的YTHDC2與較差的總生存期相關。進一步的實驗證實了YTHDC2 mRNA和蛋白在患者腫瘤中顯著下調，并且YTHDC2的下調與更大的腫瘤直徑和更晚期的腫瘤有關。表明YTHDC2抑制促進LUAD腫瘤進展。
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? ?YTHDC2通過其m6A閱讀結構域表現出抗腫瘤活性
為了探索YTHDC2的m6A reader在體內的功能，研究人員構建了有或無m6A識別YTH結構域的肺YTHDC2過表達小鼠腫瘤模型（KPYWT和KPYΔYTH）。發現盡管YTHDC2不能阻止肺腫瘤的發生，但腫瘤的發生時間被延遲，壓倒性肺腫瘤負荷被顯著抑制，KPYWT小鼠的存活時間比KPYΔYTH小鼠更長。
接下來，研究人員進一步在人LUAD細胞中探索了YTHDC2是否作為一種腫瘤抑制因子。發現在H1299細胞中過表達YTHDC2WT后，3D球狀體的數量和大小以及異種移植物的腫瘤生長均下降，過表達YTHDC2ΔYTH時則未觀察到這些作用。同樣地，敲除YTHDC2則得到相反的結果。表明YTHDC2通過其m6A閱讀結構域發揮腫瘤抑制作用。
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? ?YTHDC2抑制胱氨酸攝取和下游抗氧化程序
在具有高致瘤性的腫瘤中通常能夠觀察到代謝活性。為了研究YTHDC2對代謝產物的影響，研究人員對低和高YTHDC2表達的LUAD標本進行代謝組學分析。發現GSH代謝是被鑒定的前20個KEGG通路之一。在顯著改變的代謝物中，低YTHDC2表達的腫瘤中胱氨酸含量比高YTHDC2表達增加了3.975倍。此外，YTHDC2與細胞內胱氨酸呈負相關。表明YTHDC2降低了細胞內的胱氨酸。
緊接著，研究人員通過實驗證實了YTHDC2是通過其YTH結構域抑制了異種移植物中胱氨酸的攝取。眾所周知，胱氨酸-谷氨酸反向轉運蛋白system XC-攝取胱氨酸伴隨著谷氨酸的反向運輸。而谷氨酸釋放試驗顯示YTHDC2同樣抑制了谷氨酸的釋放。表明YTHDC2是通過抑制system XC-來降低胱氨酸攝取。
研究表明，system XC-功能受損與GSH水平降低有關，且YTHDC2確實降低了GSH。為了研究下游的胱氨酸抗氧化劑是否補償了YTHDC2的抗腫瘤作用，小鼠被給藥GSH和NAC（一種半胱氨酸前體）。結果發現NAC和GSH給藥后KPYWT小鼠肺內腫瘤負荷顯著升高，GSH/GSSG比例顯著增加。值得注意的是，NAC和GSH的補充降低了KPYWT小鼠的脂質過氧化，縮短了存活時間。表明YTHDC2的m6A閱讀功能是降低胱氨酸下游抗氧化程序所必需的。
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? ?YTHDC2抑制SLC7A11的表達
盡管system XC-功能的抑制與YTHDC2損害胱氨酸攝取有關，但YTHDC2如何調節system XC-仍不清楚。催化亞基SLC7A11在維持system XC-活性中起著重要作用。研究發現在LUAD中YTHDC2與SLC7A11呈負相關，并且體內外實驗證實了SLC7A11蛋白和mRNA水平均受到YTHDC2的負調控。此外，YTH域是YTHDC2抑制SLC7A11表達的前提。
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? ?YTHDC2通過SLC7A11損害胱氨酸攝取
隨后，研究人員探索了YTHDC2是否通過SLC7A11抑制胱氨酸攝取。結果發現異位表達SLC7A11完全恢復了YTHDC2過表達損害的胱氨酸攝取。相反，靶向SLC7A11的shRNA逆轉了YTHDC2缺失誘導的胱氨酸攝取。表明YTHDC2損害胱氨酸攝取依賴于SLC7A11。
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? ?YTHDC2加速SLC7A11 mRNA的衰減
為了進一步研究通過YTHDC2調節SLC7A11表達的潛在機制。研究人員首先通過實驗發現YTHDC2調節SLC7A11轉錄。然后，使用轉錄抑制劑ActD處理H1299和H1975細胞，以檢查YTHDC2是否在轉錄受阻后調節SLC7A11 mRNA的穩定性，結果發現YTHDC結構域對于YTHDC2縮短SLC7A11 mRNA的半衰期至關重要。通過CRISPR/Cas9使YTHDC2功能缺失后又重構YTHDC2，進一步證實YTHDC2加速了SLC7A11 mRNA的衰減。EXOSC10是一種負責3′ -5’核酸外切活性的外切酶，其缺失減少了YTHDC2對SLC7A11 mRNA半衰期的影響，表明YTHDC2促進3′ -5′ SLC7A11 mRNA降解。證實了YTHDC2在破壞SLC7A11 mRNA穩定性中的作用。
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? ?YTHDC2以m6A依賴性方式抑制SLC7A11 mRNA
YTHDC2調節SLC7A11 mRNA的穩定性，但控制RNA衰變是m6A甲基化的重要功能之一。然而，目標轉錄本的m6A甲基化是YTHDC2控制mRNA衰減的先決條件。為此，研究人員探索了YTHDC2抑制SLC7A11的功能是否依賴于m6A甲基化。結果發現只有較高的METTL3表達水平與較高的全局m6A甲基化水平相關，敲低METTL3延長了SLC7A11 mRNA的半衰期，而過表達METTL3加速了SLC7A11 mRNA的降解。此外，降低METTL3表達阻斷了YTHDC2加速SLC7A11 mRNA的衰減，損害了胱氨酸的攝取，并刺激了脂質活性氧(ROS)的產生，表明YTHDC2在LUAD細胞中的作用依賴于m6A。
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? ?SLC7A11 mRNA被m6A甲基化
為了揭示SLC7A11 mRNA中潛在的m6A甲基化位點，研究人員對METTL3敲低前后的H1975細胞進行MeRIP-seq。發現無論是否敲低METTL3，GGAC motif都高度富集在m6A位點。m6A peak峰在mRNA終止密碼子附近的3’UTR尤其豐富，SLC7A11 mRNA也不例外。隨后，研究人員通過MeRIP-qPCR以證實SLC7A11 mRNA的m6A依賴性修飾。發現敲低METTL3后，SLC7A11 mRNA中的m6A修飾顯著降低，特別是在假定的m6A位點附近。相反，當METTL3過表達時，觀察到相反的結果。表明SLC7A11 mRNA在LUAD細胞中可以被m6A甲基化。
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? ?YTHDC2優先結合m6A甲基化的SLC7A11 mRNA
雖然YTHDC2作為m6A reader，但YTHDC2是否優先結合并識別m6A甲基化的SLC7A11 mRNA尚不清楚。為此，研究人員首先進行了PAR-CLIP實驗來評估SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是否依賴于m6A甲基化。結果發現在H1299細胞中過表達METTL3增加m6A甲基化水平有助于YTHDC2與SLC7A11 mRNA的結合。而無論METTL3過表達還是敲低，YTH結構域的缺失都阻止了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用。接下來，RNA pulldown實驗顯示YTHDC2WT（而非YTHDC2ΔYTH）優先結合于含有m6A的SLC7A11 mRNA 3’UTR。最后，RIP-qPCR和METTL3功能獲得性與缺失性實驗顯示細胞內SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是由m6A水平決定的。證實了YTHDC2優先與m6A甲基化的SLC7A11 mRNA結合。
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? ?YTHDC2以m6A依賴性方式破壞SLC7A11 mRNA的穩定性
為了探索YTHDC2是否通過假定的m6A位點使SLC7A11 mRNA失穩。研究人員通過熒光素酶報告基因實驗發現，僅過表達YTHDC2WT降低了SLC7A11 mRNA的穩定性，而敲除YTHDC2可提高其穩定性。然而，與WT 3’UTR相比，Mut報告基因的這些影響減弱了。表明3’UTR上的m6A位點對于YTHDC2破壞SLC7A11 mRNA的穩定性至關重要。
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? ?YTHDC2抑制的LUAD對system XC-靶向療法敏感
臨床研究發現腫瘤組織中YTHDC2表達下調，且YTHDC2低表達的腺泡LUAD患者的總生存期要短得多，進一步證明YTHDC2抑制可能對腺泡LUAD的腫瘤進展特別重要。
最近，利用system XC-抑制劑（如erastin及其衍生物）是一種很有吸引力的癌癥治療策略。因此，研究人員探索了一種穩定的體內erastin衍生物piperazine erastin (PKE)對腺泡LUADs的潛在治療效果。發現對源自4名不同腺泡LUAD患者的PDX模型進行PKE和索拉非尼治療后可觀察到顯著的腫瘤消退。此外，PKE和索拉非尼治療的小鼠也引起腫瘤中MDA和4-HNE的顯著增加，表明誘導的脂質過氧化可能是抑制腺泡LUADs腫瘤發生的結果。
總之，本研究強調了LUAD中m6A閱讀器蛋白YTHDC2的重要性。通過抑制YTHDC2來誘導system XC-活性可促進腫瘤發生。此外，基于YTHDC2表達的分子亞型可能有助于預測LUAD患者的預后。靶向system XC-抑制劑可能有助于治療預后不良的LUAD患者。因此，這項研究在LUAD的腫瘤發生、分子亞型和藥物敏感性方面提供了有價值的見解。
原文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231720310065?via%3Dihub
