Theranostics丨RNA測序+siRNA文庫細胞功能篩選快速鑒定乳腺癌化療耐藥基因及其機理

紫杉烷類是三陰性乳腺癌（TNBC）患者的一線化療藥物；但是，化學抗性會降低其有效性。研究人員假設新輔助化療（NAC）前后腫瘤標本的分子圖譜將有助于鑒定與耐藥相關的基因。

因此，研究人員通過RNA-seq對來自于8例新輔助化療TNBC患者的10個樣品進行了測序，其中3例病理完全緩解（pCR），5例為非pCR。選擇能夠預測化療應答的差異表達基因，并通過小規模siRNA文庫進行體外功能篩選。然后，進一步在體內外研究TNBC相關基因的臨床和功能意義，并應用生化實驗和成像分析來研究其作用機制。

下面就跟隨小編一起來看看這篇文章是如何通過高通量測序、以及siRNA文庫+細胞功能篩選的方法來鑒定目標分子的吧~~~

（偷偷告訴大家，其實高通量測序與高內涵細胞功能篩選更配哦！該策略能夠極大的縮短實驗時間，充分解放人力物力，產生的實驗結果更加可靠、直觀，非常值得一試?。?/strong>

主要實驗結果

???新輔助化療下TNBC耐藥相關基因的鑒定

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首先，研究人員將接受新輔助紫杉醇和卡鉑方案治療的8例TNBC患者依據其反應分為耐藥組（n=5）和敏感組（n=3）。接下來，通過RNA-seq對從這8位患者中獲得的10個腫瘤樣品進行了測序。鑒定了434個常見基因上調，這些基因富集在ECM-受體相互作用、粘著斑、PI3K-Akt信號通路和肌動蛋白細胞骨架調控通路中（圖1B）。表明這434個基因可能是對紫杉醇和卡鉑聯合治療反應的預測因子，并選擇30個top基因進行進一步功能探索，包括SYTL4、BCAM、CTPS2、FKBP9、LAMA3、PDGFRB和ZNF160。

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?? 體外siRNA文庫功能篩選鑒定SYTL4為化療耐藥基因

接下來，研究人員對上述30個基因進行了基于siRNA文庫的篩選。通過SI方程計算出所有靶標上的紫杉醇敏化程度呈反S形曲線分布。然后通過平均SI對top基因進行排序發現SYTL4的平均SI最高。qRT-PCR和Western blot驗證了SYTL4 siRNA2可使MDA-MB-231細胞中的SYTL4表達降低至基線水平約20％，紫杉醇的IC50降低2.8倍。此外，紫杉醇的IC50值與SYTL4的表達呈正相關。因此，研究人員選擇SYTL4作為紫杉醇耐藥的主要候選基因進行進一步探索。

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???SYTL4在TNBC中的預后價值和臨床意義

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隨后，研究人員評估了SYTL4在TNBC中的預后價值。在KM-plotter公共TNBC隊列中，高表達SYTL4的無復發生存率(RFS)更差。SYTL4表達的HR在化療治療的TNBC中升高到3.04。相比之下，SYTL4 mRNA在未接受化療的亞組中預后價值不顯著。此外，在FUSCC TNBC隊列B中，232例接受輔助化療的TNBC患者（特別是紫杉醇治療的患者）高水平的SYTL4 mRNA提示更差的RFS。并且在紫杉醇治療的患者中，SYTL4的高蛋白水平與較差的無病生存期(DFS)顯著相關。表明SYTL4可作為紫杉醇治療的TNBCs預后不良的指示因子。

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???SYTL4在體內外促進TNBC紫杉醇耐藥

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體外細胞實驗顯示敲低SYTL4顯著提高了TNBC細胞系對紫杉醇的敏感性，但不影響細胞增殖。此外，SYTL4敲低細胞的IC50值也顯著更低，挽救SYTL4表達又可提高IC50值。此外，過表達SYTL4更加增加了TNBC細胞系對紫杉醇的耐藥性。體內實驗顯示沉默SYTL4增強了BALB/c裸鼠對紫杉醇的敏感性。表明在體內外改變SYTL4水平可影響TNBC細胞對紫杉醇的敏感性。

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???SYTL4與微管相互作用

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SYTL4是定位于微管細胞骨架的蛋白，因此，研究人員通過反卷積熒光顯微鏡觀察了SYTL4的分布。結果發現SYTL4與α-微管蛋白共定位。此外，SYTL4-微管蛋白復合物可以在細胞裂解液中免疫共沉淀，表明它們之間存在相互作用。通過結構化照明顯微鏡(SIM)進行超分辨率成像分析發現SYTL4的linker-C2A結構域（D2）附著于微管表面，SHD結構域（D1）呈自由分布模式，C2B結構域（D3）特異性定位于質膜（PM）附近。co-IP實驗也證實了D2與微管相互作用。表明SYTL4通過包含linker-C2A結構域的區域與微管相互作用。

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???SYTL4誘導TNBC細胞中的微管不穩定性

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紫杉醇誘導的細胞毒性主要依賴于穩定的微管。紫杉醇敏感性的增強可能由微管穩定性的提高引起的。由于SYTL4與微管相互作用，所以研究人員猜測SYTL4是否通過影響微管穩定性而賦予紫杉醇抗藥性。結果發現在有/無紫杉醇處理的TNBC細胞中，敲低SYTL4增加了微管蛋白乙酰化水平，并且穩定的微管顯著增加。此外，SYTL4的敲低也能穩定微管以抵抗冷處理。

熒光標記微管正端示蹤蛋白EB1-ΔC-GFP已成為監測活細胞中微管動態的實用工具。EB1-ΔC以“彗星”的形式結合到微管的正端，從而可以定量微管的生長速率。為了評估SYTL4對微管動力學的影響，研究人員在對照、SYTL4敲低和過表達的MDA-MB-231細胞中監測了超過15,000個EB1軌跡。發現SYTL4敲低后軌跡的增長率降低了。紫杉醇處理后軌跡的生長速率進一步表明，SYTL4敲低顯著降低了微管生長速率，而SYTL4過表達可使增長率顯著增加。表明SYTL4增加了微管生長過程中的動態不穩定性。

為了確定SYTL4是否可以抵消微管聚合，研究人員通過體外微管聚合實驗發現，作為陽性對照，紫杉醇增強了微管聚合。與陰性對照相比，SYTL4抑制體外微管聚合。表明SYTL4增加了微管聚合物的動態不穩定性，從而抵消了紫杉醇誘導的微管聚合效應。

原文鏈接：https://www.thno.org/v10p10940.htm