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CRISPR-Cas9常見問題解答（FAQ），助您輕松解決實驗困惑！

CRISPR-Cas9作為目前最常使用的基因編輯系統，已廣泛應用于人類細胞、斑馬魚、小鼠以及細菌的基因組精確修飾。CRISPR-Cas9基因編輯技術在一系列基因治療的應用領域都展現出極大的應用前景，例如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病。然而，在基因編輯實驗中我們卻經常會被一些問題所困擾，特別是對于新手小白來說。下面小編就以riboEDIT? CRISPR-Cas9為例，匯總了基因編輯實驗中常見的一些問題解答，希望可以對正在或即將要進行CRISPR-Cas9基因編輯實驗的各位小伙伴們有所幫助！

 

riboEDIT? CRISPR-Cas9是銳博生物自主開發的采用天然復合物系統的即用型(Ready-to-Use)基因編輯體系，gRNA采用crRNA和tracrRNA，提供全RNA體系(crRNA+tracrRNA+Cas9 mRNA)和RNP體系(crRNA+tracrRNA+Cas9 Protein)，充分借助化學合成技術優勢和質譜檢測以確保質量穩定，通過化學轉染、顯微注射或電穿孔/電轉進行編輯，是大規模文庫篩選的理想選擇。該體系不需要自行構建gRNA載體或Cas9載體，無需病毒實驗室，無需前期測序鑒定，無DNA組分，不整合病毒或質?；?，輕松實現單靶點或多靶點編輯，簡化基因編輯實驗步驟，數倍縮短實驗時間。還提供編輯效率保證套裝和配套必需試劑，為基因編輯提供方便、省時、高效的解決方案。

 

常見問題解答（FAQ）

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1. riboEDIT? CRIPSR-Cas9體系的gRNA是何種形式的？是100nt的體外轉錄合成的gRNA嗎？??

答：體外轉錄或克隆形成的single guide RNA（即sgRNA），長度約100 mer，需經歷搖菌培養、載體表達、挑選陽性克隆、測序鑒定等，或通過包病毒步驟，非常繁瑣。構建好的gRNA質粒、慢病毒、腺病毒會整合到宿主基因，載體體積大，免疫源性，轉染效率低、細胞毒性大、死亡率高、激活先天免疫等。

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riboEDIT CRIPSR-Cas9系統采用近兩年來被全球科學家越來越多采用的天然復合物gRNA，即crRNA和tracrRNA，無需體外轉錄，采用高通量化學合成以確保其純度、效力和批次穩定性。因不需要載體或病毒，上述問題可避免。其中，crRNA和tracrRNA為專利技術優化，縮短了堿基序列長度。不同于常規gRNA，由crRNA、tracrRNA與S. pyogenes Cas9（編碼序列經人源密碼子優化）構成編輯效率更高的CRISPR-Cas9體系，如下圖所示。

 

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2.?riboEDIT CRIPSR-Cas9體系相比于質粒載體表達Cas9和Cas9穩定表達細胞株或慢病毒系統有什么優勢？??
答：riboEDIT? CRIPSR-Cas9的全RNA體系或Cas9蛋白體系相比質粒載體或Cas9穩定表達細胞株而言具有以下優勢：

 

（1）Cas9蛋白為瞬時表達，脫靶效率低、無DNA整合風險和啟動子兼容性問題，大大提高應用安全性。

（2）即用型體系，通過一步轉染，5-6個工作日即可完成編輯效率檢測，操作簡便，顯著縮短實驗周期。

（3）不需要自行構建載體或包裝慢病毒，不需要病毒級的實驗室環境。

（4）在大部分細胞中，比質粒表達載體具有更高的基因編輯效率。

 

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3.?使用riboEDIT Cas9 mRNA進行細胞基因編輯，如何確定細胞的轉染效率？??
答：高轉染效率是獲得高效基因編輯效率的必要條件，可通過轉染EGFP mRNA或其它熒光蛋白mRNA 來確定細胞的轉染效率。riboFECT mRNA轉染試劑可實現各種細胞類型，包括干細胞和原代細胞的高效率、低毒性轉染，從而提高Cas9 蛋白剪切和基因重組效率。對于轉染試劑難以達到理想轉染效果的細胞，推薦使用電轉、顯微注射等方式，具體實驗條件需要自行優化。

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4.?riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于顯微注射？??
答：可以，riboEDIT Cas9 mRNA 濃度為0.5μg/μL，建議顯微注射前調整濃度到20-200ng/μL 范圍，并采用0.2μm針式過濾器確保去除所有可能堵塞顯微注射針頭的顆粒物或細菌。
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5.?如何快速確定crRNA的有效性？??
答：crRNA/ tracrRNA 剪切效率與crRNA識別的靶序列有關，不同的crRNA剪切活性不同，推薦通過體外酶切實驗，在體外酶切靶DNA片段，快速篩選有效的crRNA，獲得高編輯效率的crRNA再進行后續的實驗。
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6.?riboEDIT? CRISPR-Cas9基因編輯系統識別的PAM序列是什么？??
答：riboEDIT? Cas9 mRNA和riboEDIT? Cas9 Protein S. pyogenes Cas9為S. pyogenes Cas9，識別PAM序列NGG，N代表A，T，C，G。
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7.?riboEDIT? Pre-designed crRNA如何保證低的脫靶效率？??
答：從crRNA的設計角度，使用更嚴格的序列比對分析，建議每個基因至少設計3-6條crRNA進行有效性篩選。
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8.?T7EI酶切檢測編輯效率發現無剪切條帶是什么原因？??
答：可能原因如下：

 

（1）細胞轉染效率低，建議優化轉染步驟或換用容易轉染的細胞類型。

（2）Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解，可通過設置陽性對照組（riboEDIT Positive Control crRNA #1，貨號crRP0001VS）共轉染和排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的問題。

（3）在細胞內，Cas9核酸酶無法接近靶位點或無法剪切靶位點，建議重新設計crRNA。

（4）沒有進行DNA片段的變性、退火步驟?？赏ㄟ^設置陽性對照組確認實驗操作是否有誤。

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9.?瓊脂糖凝膠電泳分析剪切效率時非特異性條帶多，無法分析剪切效率怎么辦？??
答：可通過設置陰性對照組來區分目標剪切條帶和非目標條帶。必要時，需重新設計引物，或通過優化PCR條件，來降低非特異性擴增。建議采用巢式PCR，提高擴增片段的特異性。
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10.?T7E1 突變檢測時，出現條帶彌散的現象，應該如何解決？??
答: 由于T7E1 本身具有弱的非特異切割DNA 鏈的能力，所以遇到這種情況，可以增加DNA 用量，降低酶的用量，減少酶切時間來降低非特異切割現象。
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11.?對于從事諸如干細胞、原代細胞或懸浮細胞，應該選擇哪一種riboEDIT? CRIPSR-Cas9體系？??
答: 干細胞、原代細胞或懸浮細胞等難轉染細胞，轉染試劑一般很難達到理想的轉染效果，電轉方式更適合這類細胞的轉染，根據目前文獻支持，Cas9 RNP體系用于電轉具有更高的基因編輯效率，對于上述難轉染的細胞推薦用riboEDIT? CRISPR/Cas9 RNP體系，具體實驗條件需要自行優化。
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12.?riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多個靶點或基因的編輯？??
答：可以，通過混合多條crRNA與tracrRNA 和riboEDT Cas9 mRNA 共轉染，可實現對多個靶點或基因的編輯，最佳共轉染體系需自行優化，請保證crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。
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13.?mRNA 轉染與DNA 轉染相比，有哪些優勢？??
答：（1）DNA 轉染需要進入細胞核，對于快速分裂的細胞才能達到理想的轉染效果，而mRNA 轉染只需進入細胞質，可大大提高有絲分裂后細胞或緩慢分裂細胞的轉染效率。（2）沒有轉錄過程，蛋白表達更快速，縮短實驗周期。（3）更加安全，無DNA 整合風險。
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14.?如何用riboFECT? mRNA Transfection Reagent 轉染Cas9 mRNA 和sgRNA 進行基因編輯？??
答：riboFECT? mRNA Transfection Reagent 適用于轉染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的雙鏈DNA 或HDR 模板。尤其適用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共轉染進行基因編輯， 轉染步驟請參照《riboEDIT? CRISPR-Cas9 體系使用說明》實驗方法部分riboEDIT? CRISPR/Cas9 mRNA 操作說明。當利用CRISPR 做基因敲入，需自行優化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共轉染體系，以獲得最佳效果。
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15.?轉染過程中，細胞培養基內能否含有血清及雙抗？??
答：riboFECT? mRNA Transfection Reagent 是一款低毒、高效的轉染試劑，血清的存在會影響轉染復合物的形成，請確保在孵育轉染復合物時使用的是無血清培養基。孵育結束后，轉染復合物可直接加入含有或不含有血清/雙抗的細胞培養基中，無需更換培養基，操作簡便。

 

 

 

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