外泌體長鏈非編碼RNA（lncRNA）已被發現與癌癥的發生有關。然而，外泌體lncRNAs在肝細胞癌（HCC）中的表達特征及生物學作用尚不清楚。近期，Cancer Science（IF6.710）期刊在線發表了題為RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma的研究論文，系統地表征了外泌體lncRNAs在HCC-exos中的表達特征，同時鑒定出了在細胞增殖、遷移和凋亡調控中發揮重要作用的特異性DE-lncRNAs。發現lnc85可作為肝癌發生的致癌lncRNA，并且其在HCC血清中升高，在HCC診斷中顯示出了巨大的潛力。該研究為外泌體lncRNA失調與HCC之間的關系提供了新的見解，并且提示lnc85可能是HCC的潛在生物標志物。
lnc85在肝癌中的工作模型
主要研究結果
? 外泌體鑒定
首先，使用Ribo Exosome Isolation Reagent從HCC和HC（健康對照）血漿中分離出外泌體。然后，通過NanoSight、TEM和western blot對分離的外泌體進行分析。結果顯示，80%以上的粒徑在30-150 nm范圍內，在59 nm處出現峰值。TEM掃描結果表明，顆粒由雙層膜組成(~100nm)。此外，在血漿外泌體中檢測到外泌體生物標志物Alix和CD63的表達。
??外泌體lncRNAs和mRNAs在HC-exos和HCC-exos之間差異表達
隨后，研究人員進行了外泌體RNA測序，分析了HCC和HC中外泌體lncRNAs和mRNAs的表達譜。結果顯示共鑒定了8572個DE-lncRNAs，其中8447個在HCC-exos中上調，125個下調。同樣，在HCC-exos中有9440個DE-mRNAs，其中8963個上調，477個下調?；鹕綀D和層次聚類分析表明這些差異外泌體lncRNAs具有區分HCC和HC的能力。與外泌體lncRNAs類似，HCC-exos中外泌體mRNAs的表達譜也與HC-exos不同。
??與HCC-exos中的mRNAs相比，長鏈非編碼RNAs具有更高的表達水平和組織特異性以及更低的變異性和剪接效率
接著，研究人員對差異表達的lncRNAs和mRNAs進行了分析。結果發現，在HCC-exos中，lncRNAs的中位表達水平幾乎是mRNAs的兩倍，而在HC-exos中無顯著差異。在HC-exos中，外泌體lncRNAs的特異性轉錄率顯著高于外泌體mRNAs。這種現象在HCC-exos中更強。此外，無論是在HCC-exos還是在HC-exos中，lncRNAs的剪接效率都低于mRNAs。而且HCC-exos中lncRNAs的表達變異性顯著低于mRNAs。
??HCC細胞和細胞外泌體中DE-lncRNAs的qRT-PCR驗證
為了確定血漿外泌體RNA測序結果是否可以在HCC細胞中得到驗證，研究人員采用qRT-PCR檢測6個DE-lncRNAs在HCC細胞及其細胞外泌體中的表達水平。結果顯示，除lnc380外，其他5個DE-lncRNAs（lnc544、lnc239、lnc959、lnc171和lnc85）在2種HCC細胞系中的表達水平高于7702細胞。類似的，除了lnc380外，其他5個DE-lncRNAs在HCC細胞外泌體中的表達水平高于7702-exos。
??敲低HCC相關的DE-lncRNAs改變了HCC細胞的表型
??lnc85可充當miR-324-5p海綿
眾所周知，lncRNAs可作為競爭性內源性RNA（ceRNA）來調節miRNA的表達和生物學功能，并參與細胞生物學過程。為了研究DE-lncRNAs的ceRNA特征，研究人員重點關注了一種在HCC-exos中高度上調的新型lncRNA lnc85，以探索其如何影響HCC細胞的增殖和侵襲。
首先，研究人員通過RegRNA預測了lnc85的潛在靶點，發現lnc85的3′ -UTR端含有miR-324-5p的預測結合位點。隨后的雙熒光素酶報告基因實驗顯示，miR-324-5p mimic顯著抑制了HepG2和Huh7細胞中lnc85 WT 3’UTR的熒光素酶活性，而miR-324-5p mimic對突變體3’UTR的熒光素酶活性沒有顯著影響。此外，qRT-PCR分析證實，HCC細胞中miR-324-5p的表達與lnc85呈負相關。轉染si85可抑制lnc85的表達水平，但同時上調HCC細胞中miR-324-5p的表達水平。表明miR-324-5p可能作為lnc85的抑制靶點。
??lnc85通過調節miR-324-5p相關靶基因的表達促進HCC細胞增殖、轉移和凋亡
之前的研究已經證實lnc85靶向miR-324-5p，因此研究人員探索了沉默lnc85后對miR-324-5p下游靶基因表達水平的影響。結果表明，沉默lnc85顯著抑制了HCC細胞中miR-324-5p下游幾種增殖蛋白（細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白B1和c-myc）的mRNA表達水平。此外，抑制lnc85導致參與促侵襲/轉移的miR-324-5p靶標（MMP2和MMP9）的下調。表明沉默lnc85會影響mir-324-5p下游增殖、抗凋亡和轉移相關基因的mRNA表達水平，尤其是增殖和侵襲基因。
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mir-324-5p通過調節MMP2和MMP9的活性抑制HCC細胞侵襲和遷移的機制已有詳細報道。研究人員通過western blot研究了lnc85沉默后增殖相關蛋白（細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白B1）的蛋白表達水平。結果顯示，與siNC組相比，在Huh7和HepG2細胞的siRNA組中發現細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白B1的水平降低?？傊?，這些結果表明lnc85可能通過調節miR-324-5p靶基因的表達來改變這些細胞的增殖、遷移和凋亡。
? lnc85是HCC的生物標志物
DE-lncRNAs已被證實可作為人類疾病的生物標志物。RNA測序結果發現lnc85是在AFP+和AFP-HCC-exos中高度表達的DE-lncRNAs之一，并顯示出成為HCC生物標志物的潛力。為了探討lnc85是否可作為HCC的生物標志物，研究人員采用qRT-PCR檢測了lnc85在112例HCC、43例LC和52例HCC患者血清中的表達水平。結果發現與HC和LC相比，lnc85在HCC中高表達。更重要的是，lnc85的表達水平不僅在AFP+ HCC中顯著升高，而且在AFP- HCC中也高表達。
接下來，研究人員采用受試者工作特征曲線分析結果來分析lnc85的診斷價值。分析結果如下：
①當HC和LC合并為1組（HC+LC）時，lnc85的AUC對于HCC為0.873，敏感性和特異性分別為80.0%和74.5%。
②為了區分LC和HCC，lnc85的AUC為0.888，lnc85的敏感性和特異性分別為80.0%和74.4%。
③當HC和LC合并為1組（HC+LC）時，lnc85的AUC對于AFP+HCC為0.883，對于AFP-HCC為0.869。lnc85診斷AFP+ HCC的敏感性和特異性分別為80.5%和76.5%；在診斷AFP-HCC的敏感性和特異性分別為80.0%和76.5%。
④為了區分LC和AFP+或AFP-HCC，lnc85的AUC對于AFP+ HCC為0.897，對于AFP- HCC為0.883。lnc85診斷AFP+ HCC的敏感性和特異性分別為80.5%和76.7%；診斷AFP-HCC的敏感性和特異性分別為80.0%和76.7%。這意味著lnc85在AFP+和AFP-HCC中都顯示出令人信服的診斷潛力。
因此，lnc85可用作HCC診斷的獨立生物標志物，或與其他生物標志物結合以改善AFP-HCC的診斷。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cas.14516
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