Mol Cancer丨環狀RNA測序助力發現circCDYL2促進乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的機制

乳腺癌（BC）是全球最常見的惡性腫瘤，每年以0.3%的速度增長。在這些BC患者中，15-20%的人表皮生長因子受體2（HER₂）擴增/過表達，亞型為HER2陽性（HER₂⁺）乳腺癌。曲妥珠單抗是一種與HER₂細胞外結構域結合的重組mAb（單克隆抗體），是HER₂⁺?BC患者的一線推薦藥物，已被證明可延長HER₂⁺?BC患者的生存期。盡管使用曲妥珠單抗后HER₂⁺患者的預后在很大程度上是有利的，但仍有25-40%的HER₂⁺患者因曲妥珠單抗耐藥而出現復發和轉移。不幸的是，具有內在曲妥珠單抗耐藥性的HER₂⁺?BC患者從可替代的anti-HER₂藥物中獲得的生存獲益時間較短，這導致了較高的死亡率。因此，闡明HER₂⁺?BC中曲妥珠單抗耐藥的機制具有重要意義。

曲妥珠單抗治療可抑制HER₂⁺乳腺癌中HER₂蛋白的二聚化及下游信號傳導，減少DNA修復，增加細胞凋亡，并阻礙血管生成。近年來，有證據表明PI3K/AKT或RAS/ERK信號通路（HER₂下游信號通路）的異常激活在曲妥珠單抗耐藥中發揮了重要作用。因此，已有多種PI3K抑制劑和MEK抑制劑應用于HER₂⁺?BC患者，并顯示出對增加曲妥珠單抗敏感性或逆轉曲妥珠單抗耐藥性均有顯著效果。然而，PI3K/AKT或RAS/ERK的異常激活通常同時存在并協同作用導致曲妥珠單抗耐藥，這導致單一途徑的抑制對曲妥珠單抗耐藥的患者并不總是有效的。大量研究表明，多途徑靶向藥物聯合治療對HER₂⁺?BC細胞具有強大的殺傷作用。此外，許多藥物如特殊小分子化合物BEZ235（一種同時靶向mTOR和PI3K的小分子化合物），被設計用于靶向多個信號通路，以逆轉HER₂⁺?BC患者的曲妥珠單抗耐藥性。但由于缺乏足夠的有效性和安全性數據，這些新藥或多藥聯合在曲妥珠單抗耐藥患者中的臨床應用尚不明確，且大多停留在臨床前階段。因此，尋找能夠觸發多種曲妥珠單抗耐藥相關通路激活的新分子具有重要意義。

環狀RNAs（circRNAs）是一組沒有3’或5’末端的共價閉環RNA分子。CircRNAs具有疾病特異性和疾病進展特異性特征，在調節乳腺癌細胞增殖、遷移、自噬、耐藥等惡性行為方面表現出強大的生物學功能。據報道，circRNAs通過多種機制調節生物學功能，例如microRNA海綿、蛋白質翻譯或與RNA結合蛋白結合。一些circRNAs顯示出可以激活多種可能導致曲妥珠單抗耐藥的信號通路。例如，circMAT2B促進心肌細胞中PI3K/AKT和Raf/MEK/ERK通路的激活。然而，目前尚無直接證據表明circRNAs在HER₂⁺?BC患者曲妥珠單抗耐藥中的作用。

近日，Molecular Cancer（IF27.401）期刊在線發表了題為circCDYL2 promotes trastuzumab resistance via sustaining HER2 downstream signaling in breast cancer的研究論文，報道了circCDYL2-GRB7-FAK復合物在維持HER₂信號傳導中發揮了關鍵作用，并有助于曲妥珠單抗耐藥，揭示了circCDYL2是HER₂⁺?BC患者曲妥珠單抗耐藥的潛在生物標志物。

由于曲妥珠單抗耐藥患者預后較差，探索能夠預測曲妥珠單抗療效的分子標記物及治療曲妥珠單抗耐藥的靶點具有重要意義。為了研究circRNAs是否以及如何維持HER₂信號通路的活性，從而導致曲妥珠單抗耐藥。研究人員對具有不同曲妥珠單抗反應的HER₂⁺乳腺癌組織進行了circRNAs高通量篩選和qRT-PCR檢測，以鑒定了曲妥珠單抗耐藥相關circRNAs。結果發現與曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌組織相比，在曲妥珠單抗敏感的乳腺癌組織中，共有3498個circRNAs出現失調，其中3356個上調和138個下調。進一步研究發現circCDYL2、circSPECC1L和circSAT1在曲妥珠單抗耐藥亞組中均顯著上調。實時熒光定量PCR分析表明，僅circCDYL2（hsa_circ_0004087，chr16:80718434–80719026；來自CDYL2基因exon 2）在曲妥珠單抗耐藥細胞系中比親代細胞系高表達。此外，研究發現circCDYL2在HER₂陽性亞型中的表達高于HER₂陰性亞型。臨床分析顯示，與具有低circCDYL2水平的患者相比，具有高水平circCDYL2的HER₂⁺?BC患者在anti-HER₂治療后出現快速復發并且具有更短的無病生存期（DFS）和總生存期（OS），并且circCDYL2表達水平較高的腫瘤，Ki-67、P-AKT和P-ERK的表達水平也較高。表明circCDYL2表達與HER₂⁺?BC患者曲妥珠單抗耐藥相關，并與AKT和ERK的磷酸化相關。

Fig1. Anti-HER₂治療后乳腺癌中曲妥珠單抗耐藥相關circRNA（circCDYL2）的鑒定

隨后，研究人員通過細胞活力測定、集落形成測定、EdU測定、患者來源的異種移植物（PDX）模型和原位動物模型檢測曲妥珠單抗耐藥相關circRNA的生物學作用。結果發現circCDYL2促進了PDX模型和HER₂⁺細胞對曲妥珠單抗的耐藥性。

Fig2. circCDYL2促進PDX模型中曲妥珠單抗耐藥

最后，研究人員通過免疫共沉淀、Western blot、免疫熒光和pull down試驗證實了circRNA和結合蛋白的相關機制。發現circCDYL2通過阻止GRB7的泛素化降解并增強其與FAK的相互作用來穩定GRB7，從而維持下游AKT和ERK1/2的活性。此外，FAK或GRB7抑制劑可逆轉具有高circCDYL2表達的HER₂^+?BC細胞的曲妥珠單抗耐藥性。

Fig3.?circCDYL2作為支架促進GRB7和FAK的結合，從而維持HER₂下游信號傳導并導致HER₂⁺?BC患者的曲妥珠單抗耐藥

總之，本研究鑒定了一個circRNA circCDYL2，其在HER₂⁺?BC患者的曲妥珠單抗耐藥中發揮了關鍵作用。機制研究證明了circCDYL2-GRB7-FAK復合物在HER₂⁺乳腺癌細胞中起關鍵作用，并促進了HER₂⁺乳腺癌的進展。臨床上，circCDYL2可以作為一種預測HER₂⁺?BC患者預后的新分子，并證明了FAK或GRB7抑制劑可用于逆轉HER₂⁺?BC患者的曲妥珠單抗耐藥。

原文鏈接：https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-021-01476-7#MOESM1