阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是一種非常普遍的慢性睡眠障礙，以睡眠中反復發生的部分或完全咽部塌陷為特征，伴有慢性間歇性缺氧（CIH）。OSA被鑒定為是發生全身性高血壓的獨立危險因素。大約50%的OSA患者有高血壓，估計有70-85%的頑固性高血壓患者有OSA。然而，OSA誘發高血壓的確切機制尚不完全清楚。越來越多的證據表明，以內皮依賴性舒張功能受損為特征的血管內皮功能障礙，是OSA中出現臨床上明顯的心血管并發癥之前血管損傷的最早跡象。因此，對CIH狀態下內皮功能障礙的分子機制進行整體分析，將有助于全面了解OSA或CIH相關性高血壓的發病機制。
氧化應激通過促進NO解偶聯導致內皮功能障礙?？寡趸D錄因子NRF2保留內皮功能并防止Ang II誘導的高血壓。已有報道稱CIH通過抑制NRF2蛋白表達誘導心肌損傷，但NRF2是否介導CIH相關的內皮功能障礙和高血壓尚不清楚。
細胞外囊泡（EVs）分泌進入血液或其他體液中是發生在多細胞生物中的普遍細胞過程。EVs作為細胞間通訊的重要介質，通過將復雜分子遞送給受體細胞來發揮多方面的功能，從而參與多種生理和病理過程的調節。內皮細胞是已知的吸收EVs的主要細胞類型。與內皮細胞直接和持續接觸的循環EVs可以被內皮細胞吸收，從而影響血管生成、血管通透性和血管張力的調節。之前的研究表明，在糖尿病相關心肌梗死中，循環外泌體miR-144-3p抑制內皮祖細胞的遷移，進而損害新血管形成。然而，很少有研究關注循環EVs對CIH相關內皮功能障礙和高血壓的作用及詳細機制。
近日，Theranostics期刊在線發表了一篇題為Extracellular vesicle-derived miR-144 as a novel mechanism for chronic intermittent hypoxia-induced endothelial dysfunction的研究論文。報道了一種細胞外囊泡來源的miR-144作為慢性間歇性缺氧誘導的內皮功能障礙的新機制，暗示負載anti-miR-144的細胞外囊泡可能是治療阻塞性睡眠呼吸暫?；蚵蚤g歇性缺氧相關內皮功能障礙的一種有希望的方法。
首先，研究人員發現C57BL/6小鼠經過30天CIH處理后，嚴重減弱了其胸主動脈和頸動脈的內皮依賴性舒張（EDR），并顯著升高血壓 ，尤其是收縮壓，但在CIH處理后重新給予正常氧氣15天，這種影響被逆轉。為了確定CIH誘導內皮功能障礙的機制，研究人員通過微陣列分析以鑒定C57BL/6小鼠在常氧（N）、CIH（C）和30天CIH后15天常氧（Re-Nor post-CIH）條件下主動脈中的差異表達基因。結果在CIH與常氧小鼠中鑒定了743個顯著差異表達的編碼基因，其中只有NRF2與血管收縮和擴張、活性氧（ROS）生成、炎癥和血管生成均相關。Western-blotting結果顯示，CIH暴露30天的C57BL/6小鼠的主動脈中NRF2及其下游靶標 CATALASE（CAT）的水平顯著降低，并且在Re-Nor post-CIH組中恢復。此外，研究發現CIH處理的小鼠主動脈內皮細胞中超氧化物的產生明顯增加。
Fig1. CIH處理會損害EDR、降低NRF2表達并促進超氧陰離子的產生
為了探索CIH S-EVs對EDRs的影響，研究人員評估了S-EVs的特征。結果顯示，從正常C57BL/6小鼠中分離出的大多數S-EVs呈現出直徑約100nm的典型圓盤狀囊泡。EV標志物，尤其是外泌體相關蛋白CD9、CD63、CD81、ALIX和TSG101在EV組分中富集。納米粒子追蹤分析顯示，300μL血清產生的S-EVs的平均尺寸為111.0±57.2 nm，而CIH S-EVs的數量約為常氧組（Nor S-EVs）的2倍。En face染色表明PKH67標記的C57BL/6小鼠S-EV以時間依賴性方式被內皮細胞吸收。
Fig2. 從C57BL/6小鼠血清中分離的細胞外囊泡可被主動脈內皮細胞吸收
接著，研究人員發現直接暴露于CIH S-EVs 48h可減弱C57BL/6小鼠胸主動脈中的EDR，并減少C57BL/6小鼠腸系膜動脈中的血流介導性擴張。聯合肝素（EV吸收阻斷劑）處理可逆轉CIH s -EV對小鼠主動脈EDR的損害。為了進一步確定CIH S-EVs如何對EDR產生不利影響，研究人員通過轉錄組微陣列分析來鑒定CIH S-EVs或Nor S-EVs處理的HUVECs中的差異表達基因。結果鑒定出19個顯著差異表達的編碼基因，其中，Nrf2是CIH S-EV處理的HUVEC和CIH處理的小鼠主動脈唯一共有的差異表達基因。進一步的驗證表明，CIH S-EV離體處理確實降低了NRF2及其靶點CAT在小鼠內皮細胞系H5V和小鼠主動脈中的蛋白表達。此外，CIH S-EV處理48h可增加H5V細胞和主動脈內皮細胞中超氧陰離子的產生。表明NRF2降低可能是導致CIH S-EV誘導的內皮細胞超氧陰離子過度產生的主要分子。
Fig3. CIH S-EVs損害內皮功能，增加超氧陰離子的產生，并降低內皮細胞中NRF2的表達
為了確定CIH S-EVs降低NRF2和受損內皮功能的機制，研究人員通過qPCR檢測了常氧和CIH處理的小鼠S-EVs中與氧化應激或缺氧信號相關的幾個EV相關miRNAs。結果顯示，CIH S-EVs中miR-126的水平降低，而miR-132、miR-150、miR-27a和miR-144的水平升高。之前的研究表明在Nrf2的3′-UTR中存在miR-27a和miR-144a的保守結合序列，使用agomiR-144和agomiR-27a過表達miR-144和miR-27a會降低H5V中NRF2及其靶標CAT的蛋白質水平，并抑制293A細胞中Nrf2-3’UTR驅動的熒光素酶活性。
此外，qPCR結果顯示，在間歇性缺氧（IH）處理24h后，成熟的miR-27a及其初級轉錄本pri-miR-27a（但不是miR-144或pri-miR-144）在H5V中被誘導，表明除miR-144外，miR-27a在內皮細胞中內源性表達，并對IH刺激有反應。在H5V細胞中幾乎檢測不到miR-144的表達，但CIH S-EV處理顯著增加了H5V細胞中miR-144的豐度。而無論是否用放線菌素D抑制內源性miRNA的產生，這種效應都持續存在，表明內皮miR-144信號主要來自S-EVs。 因此，選擇EV miR-144作為進一步研究的目標分子。
Fig4. miR-144在CIH S-EVs中增加，并通過S-EVs遞送至內皮細胞
由于miR-144主要在紅細胞中表達并參與紅系分化。為了闡明miR-144在CIH S-EV中的細胞來源，研究人員通過超離心從C57BL/6小鼠紅細胞中分離出紅細胞來源的細胞外囊泡（E-EVs），并對其進行表征。結果顯示E-EVs呈現典型的圓盤形狀，平均直徑為115.0±50.9nm。此外，在E-EV組分中還觀察到紅細胞蛋白HBA。qPCR分析顯示miR-144在CIH處理的C57BL/6小鼠紅細胞和OSA患者紅細胞的E-EVs中顯著上調。
Fig5. E-EVs的表征和E-EVs中miR-144的表達
為了進一步證明EV介導的紅細胞和內皮細胞之間的細胞間通訊，研究人員檢測了常氧、30天CIH或30天CIH后15天常氧條件（CIH-R-N）處理后C57BL/6小鼠紅細胞和內皮細胞中pri和成熟miR-144的水平。qPCR結果表明miR-144和pri-miR-144的表達在紅細胞中占優勢，而不是在內皮細胞中。CIH狀態下，pri-miR-144和miR-144在紅細胞中的表達顯著升高，恢復常氧15天后趨勢逆轉；而在主動脈內皮細胞中，只有miR-144被上調，表明內皮細胞中的miR-144極有可能從體內紅細胞外源性轉移。接下來，研究人員通過一系列實驗探索了缺氧狀態下紅細胞中miR-144的分子調控作用。結果表明，缺氧時miR-144可直接受HIF-1α調控或受HIF-1α/GATA1通路間接調控。
Fig6. 間歇性缺氧時紅細胞中miR-144的表達與調控
最后，為了進一步驗證CIH E-EVs遞送miR-144對內皮細胞的影響，研究人員使用anti-miR-144 和負載anti-miR-144的CIH E-EVs在體外治療主動脈或在體內治療CIH小鼠。結果顯示，負載anti-miR-144的CIH E-EV在孵育48h后并未增加H5V細胞中的miR-144水平，且H5V細胞中NRF2和CAT的蛋白質水平保持在對照組中觀察到的水平。一致地，通過尾靜脈注射進行的體內CIH E-EV治療可增強內皮細胞中超氧陰離子的產生。然而，這種作用在負載anti-miR-144的CIH E-EV治療組中在很大程度上被抑制。同時，CIH E-EVs的體內治療會損害常氧和CIH治療小鼠的EDR并增加收縮壓。這些影響在用anti-miR-144負載的CIH E-EVs治療組中降低。同樣，antagomiR-144顯著逆轉了由CIH小鼠或OSA患者E-EV引起的內皮功能障礙。
Fig7. Anti-miR-144可逆轉CIH E-EV誘導的超氧陰離子過度產生、NRF2減少和內皮功能障礙
總之，本研究系統地證明了CIH S-EV和CIH E-EV可以將功能性miR-144傳遞給內皮細胞，通過降低NRF2表達來促進超氧陰離子的產生。該研究結果為負載anti-miR-144的EV或antagomir-144在治療OSA或CIH相關血管并發癥中的治療潛力提供了實驗證據。
原文鏈接：https://www.thno.org/v12p4237.htm
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