冰凍組織切片樣品制備方法

組織采集后，經固定、冷凍、切片、晾片，方可進行免疫抗體標記。

1、組織的采集、固定和保存：

不同來源的組織可依據實驗條件和實驗目的而考慮采用不同的固定和保存方法。此處介紹幾種實驗室常用方法。
1)液氮冷凍法：
采取新鮮組織后，即可放入液氮中，并保存于液氮中。
2)固定法：
采取新鮮組織后，4%多聚甲醛(4%PFA)4°C 固定1小時(根據組織大小和致密程度調整固定時間)或過夜，PBS緩沖液洗三次，每次10-30min，20%蔗糖中浸泡1小時或過夜，4°C保存于20%蔗糖(含0.05%NaN3)中。

2、組織的冷凍和切片：

組織的冷凍方法可根據固定和保存條件不同而不同。使用冷凍切片機，將組織冰切成4-20μm的切片，粘貼于處理過的載玻片上，室溫干燥1小時后，可進行免疫標記?；蚍湃胼d片盒，-80°C密閉保存。
1)氣體CO₂冷凍法：
將樣品置于樣品臺的OCT中，打開鋼瓶開關，CO₂氣體噴出，迅速冷凍組織樣品。
2)干冰冷凍法：(適合小塊和致密度低的組織，如胚胎、小塊組織、活檢組織等)
將小組織塊放入冷凍包埋模具中，調整切面位置(必要時可在體視鏡下操作)后，置于干冰上(暫時無干冰，可置于-80°C)，待冷凍完全后，-80°C密閉保存。
3)直接冷凍法：
將樣品直接粘著在涂有OCT的樣品臺上，于冰切機(箱體溫度-80°C)中直接冷凍。

3、冰凍組織切片的化學熒光標記：

將冰凍組織切片從-80°C 冰箱中取出，室溫放置10min, 待切片回溫并干燥，PBS 10min洗去OCT，可無需Triton處理，即可進行化學熒光標記，操作步驟請參見試劑盒使用方法。

4、冰凍組織切片的免疫熒光標記：

將冰凍組織切片從-80°C 冰箱中取出，室溫放置10min, 待切片回溫并干燥，PBS 10min洗去OCT，可無需Triton處理，即可進行免疫抗體標記，操作步驟請參見免疫標記方法。

5、冰凍組織切片的免疫酶反應：(酶聯免疫反應，在抗體作用之前或顯色時組織樣品需進行內源性酶抑制作用，以降低反應背景)

1)堿性磷酸酶（AP）：

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V
二甲苯透明
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V
中性樹膠封片

2)辣根過氧化物酶（HRP）：