最近小編從銳博在線平臺收到一些客戶咨詢riboEDIT CRISPR-Cas9基因編輯體系及產品，也看到不少客戶已在平臺上訂購了產品，效果反饋還是一如既往的高效。
對大家普遍關心的CRISPR-Cas9基因編輯體系的疑問以及在使用過程中的注意事項，選擇好一個適合的CRISPR體系和制定實驗方案，實驗也就成功了一半！這不小編再次梳理了有關CRISPR-Cas9常見問題解答和實驗攻略，希望對小伙伴們有所幫助。
1、riboEDIT CRISPR-Cas9體系是什么？
riboEDIT CRISPR-Cas9體系是銳博生物自主開發的采用天然復合物系統（crRNA和tracrRNA）的一種CRISPR基因編輯系統，提供基于Cas9 mRNA的全RNA體系和基于Cas9蛋白的RNP體系，tracrRNA可實現大規模合成，靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成，通過化學轉染、顯微注射或電轉方式便可以便捷地進行基因編輯實驗。
2、riboEDIT CRISPR-Cas9體系提供哪些產品？具有哪些優勢？
該體系提供一系列方便高效的基因編輯產品，如果您希望篩選有效的gRNA，您可以選擇訂購編輯效率保證套裝或標準套裝，您還可以根據自己的實驗情況選擇：設計合成crRNA、通用型tracrRNA、Cas9 mRNA、Cas9蛋白 、mRNA轉染試劑、mRNA轉染對照（EGFP）、陽性對照crRNA套裝、T7E1酶等產品。
采用riboEDIT CRISPR-Cas9體系的優勢有：
■ ?銳博已申請專利，采用優化的crRNA，tracrRNA和Cas9 mRNA
■ ?瞬時表達，有效降低脫靶率
■ ?無DNA組分，不整合任何病毒或質粒基因
■ ?編輯效率更高，適用于哺乳動物細胞
■ ?毒性更低，激活先天免疫反應更小，減少細胞死亡
■ ?允許通過一次轉染同時靶向多個基因進行編輯
■ ?無需繁瑣的克隆構建過程，節約更多人力和時間
■ ?無需病毒級實驗室，大大降低基因編輯對實驗環境的要求
■ ?即用型體系，更加易用，更適合從小規模實驗到大規模高通量篩選
■ ?兼容化學轉染（mRNA轉染/蛋白轉染）、電轉或電穿孔、顯微注射
3、riboEDIT CRISPR-Cas9體系適用哪些實驗？
riboEDIT CRISPR-Cas9體系可用于編輯哺乳動物的腫瘤細胞、動物受精卵、干細胞（如動物胚胎干細胞、多功能干細胞或造血干細胞等）、T細胞、原代細胞、祖細胞等，如果您希望獲得哺乳動物細胞的單/多基因敲除、細胞改造、構建穩轉株、構建動物受精卵、胚胎干細胞或從受精卵開始大規模構建模式動物，那么riboEDIT CRISPR-Cas9就非常適合了。
4、riboEDIT CRISPR-Cas9體系常見FAQ？
Q1：riboEDIT CRIPSR-Cas9體系相比于質粒載體表達Cas9和Cas9穩定表達細胞株或慢病毒系統有什么優勢？
1. riboEDIT CRIPSR-Cas9的全RNA體系或Cas9蛋白體系相比質粒載體或Cas9穩定表達細胞株而言，Cas9蛋白為瞬時表達，脫靶效率低、無DNA整合風險和啟動子兼容性問題，大大提高應用安全性。
2. 即用型體系，通過一步轉染，5-6個工作日即可完成編輯效率檢測，操作簡便，顯著縮短實驗周期。
3. 不需要自行構建載體或包裝慢病毒，不需要病毒級的實驗室環境。
4. 在大部分細胞中，比質粒表達載體具有更高的基因編輯效率。
Q2：使用riboEDIT Cas9 mRNA進行細胞基因編輯，如何確定細胞的轉染效率？
高轉染效率是獲得高效基因編輯效率的必要條件，可通過轉染EGFP mRNA （貨號：C11061-1）或其它熒光蛋白mRNA 來確定細胞的轉染效率。riboFECT mRNA Transfection Reagent 轉染試劑可實現各種細胞類型，包括干細胞和原代細胞的高效率、低毒性轉染，從而提高Cas9 蛋白剪切和基因重組效率。對于轉染試劑難以達到理想轉染效果的細胞，推薦使用電轉、顯微注射等方式，具體實驗條件需要自行優化。
Q3：riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于顯微注射？
可以，riboEDIT Cas9 mRNA 濃度為0.5μg/μL，建議顯微注射前調整濃度到20-200ng/μL 范圍，并采用0.2μm針式過濾器確保去除所有可能堵塞顯微注射針頭的顆粒物或細菌。
Q4：如何快速確定crRNA的有效性？
crRNA/tracrRNA 剪切效率與crRNA識別的靶序列有關，不同的crRNA剪切活性不同，推薦通過體外酶切實驗，在體外酶切靶DNA片段，快速篩選有效的crRNA，獲得高編輯效率的crRNA再進行后續的實驗。
Q5：riboEDIT CRISPR-Cas9基因編輯系統識別的PAM序列是什么？
riboEDIT Cas9 mRNA和riboEDIT Cas9 Protein S. pyogenes Cas9為S. pyogenes Cas9，識別PAM序列NGG，N代表A，T，C，G。
Q6：riboEDIT Pre-designed crRNA如何保證低的脫靶效率？
從crRNA的設計角度，使用更嚴格的序列比對分析，建議每個基因至少設計3-6條crRNA進行有效性篩選。
Q7：T7EI酶切檢測編輯效率發現無剪切條帶是什么原因？
可能原因如下：
1. 細胞轉染效率低，建議優化轉染步驟或換用容易轉染的細胞類型。
2. Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解，可通過設置陽性對照組（riboEDIT Positive Control crRNA #1，貨號crRP0001VS）共轉染排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的問題。
3. 在細胞內，Cas9核酸酶無法接近靶位點或無法剪切靶位點，建議重新設計crRNA。
4. 沒有進行DNA片段的變性、退火步驟。可通過設置陽性對照組確認實驗操作是否有誤。
Q8：瓊脂糖凝膠電泳分析剪切效率時非特異性條帶多，無法分析剪切效率怎么辦？
可通過設置陰性對照組來區分目標剪切條帶和非目標條帶。必要時，需重新設計引物，或通過優化PCR條件，來降低非特異性擴增。建議采用巢式PCR，提高擴增片段的特異性。
Q9：T7E1 突變檢測時，出現條帶彌散的現象，應該如何解決？
由于T7E1 本身具有弱的非特異切割DNA 鏈的能力，所以遇到這種情況，可以增加DNA 用量，降低酶的用量，減少酶切時間來降低非特異切割現象。
Q10：對于從事諸如干細胞、原代細胞或懸浮細胞，應該選擇哪一種riboEDIT CRIPSR-Cas9體系？
干細胞、原代細胞或懸浮細胞等難轉染細胞，轉染試劑一般很難達到理想的轉染效果，電轉方式更適合這類細胞的轉染，根據目前文獻支持，Cas9 RNP體系用于電轉具有更高的基因編輯效率，對于上述難轉染的細胞推薦用riboEDIT CRISPR/Cas9 RNP體系，具體實驗條件需要自行優化。
Q11：riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多個靶點或基因的編輯？
可以，通過混合多條crRNA與tracrRNA 和riboEDT Cas9 mRNA 共轉染，可實現對多個靶點或基因的編輯，更佳共轉染體系需自行優化，請保證crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。
Q12：mRNA 轉染與DNA 轉染相比，有哪些優勢？
1. DNA 轉染需要進入細胞核，對于快速分裂的細胞才能達到理想的轉染效果，而mRNA 轉染只需進入細胞質，可大大提高有絲分裂后細胞或緩慢分裂細胞的轉染效率。
2. 沒有轉錄過程，蛋白表達更快速，縮短實驗周期。
3. 更加安全，無DNA 整合風險。
Q13：如何用riboFECT mRNA Transfection Reagent 轉染Cas9 mRNA 和sgRNA 進行基因編輯？
riboFECT mRNA Transfection Reagent 適用于轉染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的雙鏈DNA 或HDR 模板。尤其適用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共轉染進行基因編輯， 轉染步驟請參照《riboEDIT CRISPR-Cas9 體系使用說明》實驗方法部分riboEDIT CRISPR/Cas9 mRNA 操作說明。當利用CRISPR 進行基因敲入，需自行優化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共轉染體系，以獲得效果。
Q14：轉染過程中，細胞培養基內能否含有血清及雙抗？
riboFECT mRNA Transfection Reagent 是一款低毒、高效的轉染試劑，血清的存在會影響轉染復合物的形成，請確保在孵育轉染復合物時使用的是無血清培養基。孵育結束后，轉染復合物可直接加入含有或不含有血清/雙抗的細胞培養基中，無需更換培養基，操作簡便。
