Cell正刊 | 乳酸是靶向MAVS的RLR天然抑制劑
乳酸曾被認為是糖代謝過程無用的副產物，后續研究中發現乳酸在諸多分子機制的調控中起重要的調節作用，包括調控巨噬細胞極化、輔助T細胞分化以及腫瘤細胞免疫監控的調節。到目前為止，沒有確定乳酸的直接蛋白質靶標，乳酸是否通過直接蛋白質靶向參與其他細胞內信號轉導和生物學分子機制仍有待確定。視黃酸誘導基因I樣受體(retinoic-acid inducible gene I -like receptor, RLR)可介導干擾素（IFN）的生產，作為先天免疫的重要組份對病毒清除和癌癥免疫監視等方起關鍵作用。然而，乳酸對調節免疫細胞功能發揮的作用，以及乳酸是否參與RLR信號介導IFN的機理仍然不清楚。
2019年5月，軍事醫學科學院生物醫學分析中心張維娜課題組最近與美國維克森林大學Hui-Kuan Lin合作在國際頂級期刊Cell發表學術論文：Lactate Is a Natural Suppressor of RLR Signaling by Targeting MAVS，發現乳酸竟然是靶向MAVS的RLR天然抑制劑，并闡明了乳酸參與RLR信號介導IFN的機理。
研究人員發現，糖酵解產物在RLR活化期間阻礙IFN的產生，RLR觸發MAVS-RIG-I識別己糖激酶，使己糖激酶與線粒體抗病毒信號傳導蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS)結合，導致己糖激酶的亞細胞定位和激活受損。研究還發現，乳酸通過直接結合MAVS跨膜（TM）結構域，阻止MAVS聚集從而抑制RLR介導的信號傳導。通過引入乳酸脫氫酶抑制劑調節乳酸脫氫酶的水平，發現當乳酸脫氫酶A（LDHA）失活導致的乳酸減少時，會增加I型IFN的產生，從而保護小鼠免受病毒感染。另外，炎癥狀態下，乳酸的補充可逆轉由乳酸缺乏引起的IFN產生增加。此研究確定了糖酵解衍生的乳酸在限制RLR信號傳導中的關鍵作用，并將MAVS鑒定為乳酸的直接傳感器，可作為能量代謝和先天免疫的樞紐。
在實驗中，研究人員采用siRNA沉默若干乳糖代謝相關基因（如：單羧酸轉運蛋白MCT1、己糖激酶HK、乳酸脫氫酶LDHA等）轉錄水平的表達以研究乳糖與IFN、MAVS的作用關系 （siRNA: human MCT1來自于銳博生物的genOFF文庫產品，貨號為stB0007914A和stB0007914B）。
通過siRNA:human MCT1 對MCT1m RNA進行干擾，以阻礙細胞對乳酸的攝取和轉運，細胞水平為例，對照組中格外添加lactate的組較野生型IFN顯著下調，而SiRNA干擾MCT-1的兩平行組則無變化；在mRNA轉錄水平，qPCR檢測兩平行組均可降至20%左右，顯著性分析p < 0.01?？梢姡瑂iRNA對MCT-1的干擾效果顯著，阻礙細胞對乳糖的攝入，為乳糖干擾IFN表達提供直觀的證據。
研究速讀
1.通過LDHA揭示乳糖對RLR信號干擾
乳糖脫氫酶LDHA是無氧糖酵解的關鍵酶，可催化丙酮酸生成乳酸。通過應用遺傳和藥理學方法探究LDHA相關乳酸是否在負調節I型IFN中發揮作用。結果表明，LDHA的敲低增強了TBK1和IRF3的磷酸化并增強RLR激活后的IFN-β產生（下圖A-D）。與LDHA敲低類似，使用LDHA抑制劑草氨酸鈉（sodium oxamate）可降低乳酸水平并增強IFN-β產生，從而抑制病毒復制（下圖E-H）
?此外，向草氨酸鈉處理的細胞中添加乳酸阻礙LDHA抑制劑對IFN-β促進的作用（下圖I）。乳酸的添加破壞了2-DG對IFN-β誘導及其上游信號傳導的影響（下圖J）。在己糖激酶HK敲低的細胞中也觀察到類似的結果（下圖K）。研究中還發現乳酸的添加恢復了半乳糖對IFN-b誘導和病毒復制的影響（下圖L）。
LDHA敲低后對(A)乳糖的影響 (B)INF-β轉錄水平的影響 (C) INF-β蛋白水平的影響 (D)修復LDHA對INF-β轉錄水平的影響;
添加LDHA抑制劑草氨酸鈉后對 (E)乳糖的影響 (F)INF-β轉錄水平的影響 (G)Sev病毒侵入下INF-β轉錄水平的影響 (H)對入侵病毒Sev復制的影響;
細胞中添加乳酸前后（I）草氨酸鈉對IFN-β轉錄水平的影響（J）乳糖對2DG誘導IFN-β的影響（K）己糖激酶敲低下對IFN-β的影響（L）半乳糖對對IFN-β的影響
2. LDHA生產的乳酸通過靶向MAVS負調節RLR激活
為確定乳酸對RLR信號傳導的作用的直接靶標，研究中利用生物素標記的乳酸進行測定；主要專注于參與RLR信號傳導激活的關鍵蛋白（包括RIG-I，MDA5，TBK1，MAVS和IRF3）發現乳酸與MAVS存在特異性相互作用（下圖A）、MAVS在不同生理條件下與乳酸鹽相互作用（圖B和C）。
(A)免疫印跡分析生物素標記的乳酸結合物 ?(B) 熒光分析細胞的IgG及mavs抗體對乳酸相互作用 (C)熒光分析細胞的IgG及mavs抗體對乳酸相互作用丙酮酸相互作用
為了探索乳酸和MAVS之間的詳細相互作用，研究人員對其結構域進行分析，發現乳酸-MAVS的結合需要MAVS中的TM結構域，通過合成MAVS的TM結構域（514-535aa）并對其N末端加上一段TAT標簽。在體外實驗中發現TM肽能夠有效中斷乳酸與MAVS的結合。
體內實驗，通過人免疫缺陷病毒TAT中TAT肽的細胞穿透性（CPP）將大分子送到細胞中以測試它們的生物學功能。利用CPP將TM肽送進入細胞內使用免疫熒光觀察（下圖J）確定了TM肽對RLR誘導的I型IFN產生的影響。此外，向細胞中添加TM肽可促進RLR活化（下圖K）并阻礙乳酸對IFN-b和IL-6產生的抑制作用（下圖L）。
(A)MAVS染色TAT抗體染色，免疫熒光分析TM肽作用(B) TM肽轉染細胞后IFN-β表達的qPCR分析（C）qPCR分析經草酸鈉、TM肽、乳酸對細胞IFN-β表達的影響
這些結果表明乳酸通過其與MAVS的TM結構域的結合來抑制RLR信號傳導。
3. 乳酸抑制MAVS線粒體定位、RIG-I-MAVS和MAVS聚合
為進一步揭示乳酸抑制RIG-I-MAVS誘導RLR活化的潛在機制，研究人員增加草氨酸鹽（乳酸脫氫酶抑制劑）抑制乳酸產生后， MAVS線粒體定位清晰，而添加乳酸后破壞了這種現象（圖A和B）。另外MAVS的TM結構域缺陷型不能在線粒體中定位且不能與活化的RIG-I相互作用（圖C）。
(A)免疫熒光分析乳酸/草氨酸對MAVS的細胞定位的影響 (B)體免疫印跡分析乳酸/草氨酸對MAVS的細胞定位的影響 （C）體免疫印跡分析TM結構對RIG-I相互作用
為探究乳酸對RIG-I MAVS的影響，研究中通過活化的RIG-I誘導體外MAVS聚集測定，并將乳酸鹽與活化的RIG-I蛋白及線粒體一起孵育。結果顯示當存在線粒體和K63連接的泛素鏈（K63-Ub4）的情況下，純化的GST-RIG-I（N）在體外觸發了顯著的MAVS聚集。另外，乳酸擁有顯著阻礙MAVS聚集的能力（圖F）。
?(圖F)體外MAVS聚集的免疫印跡分析
總之，本研究發現乳酸可靶向MAVS的TM結構域以阻礙其線粒體定位和RIG-I-MAVS復合物形成，從而損害MAVS聚集及其下游信號傳導激活，證明MAVS與乳酸的結合使MAVS線粒體定位破壞，從而減弱RLR信號傳導和下游I型IFN產生。
文中討論部分提及癌細胞逃避免疫機制監視的一個潛在機制可能與乳酸限制I型INF的產生有關，并為各種人類疾?。ㄈ绮《靖腥竞桶┌Y）調控提供了重要的理論依據和策略：將MAVS的TM肽應用于治療中，不僅可以提高正常條件下IFN的產生，而且可以減輕乳酸對RLR介導的IFN產生的抑制作用；此外，有望通過靶向乳酸脫氫酶的藥物，抑制乳酸的生產以加強宿主先天免疫反應，提高I型干擾素生產來病毒清除和癌癥免疫監測。
詳情請查閱原文：
Weina Zhang, Guihua Wang, Zhi-Gang Xu et al., Lactate Is a Natural Suppressor of RLR Signaling by Targeting MAVS [J] Cell 178, 1–14 https://doi.prg/10.1016/j.cell.2019.05.003
