重磅丨銳博外泌體miRNA-seq和Agomir助力心臟保護運動因子發現

運動訓練除了降低心血管危險因素外，可直接預防心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷，還與提高人類心臟病發作存活率有關。然而，運動所提供的心臟保護的潛在機制仍不清楚。研究表明運動誘導的循環外泌體可能對心血管具有重要益處，為了揭示運動衍生的循環外泌體在心臟保護中的作用及其分子機制，第四軍醫大學高峰、王立峰課題組在Circulation Research（影響因子：15.211）上發表了題為Longterm Exercise-Derived Exosomal miR-342-5p的重要成果。該研究揭示了一種新的內源性心臟保護機制：長期運動衍生的循環外泌體通過外泌體miR-342-5p保護心臟免受心肌缺血/再灌注損傷。

研究結果

1、四周游泳訓練保護大鼠心臟免受MI/R損傷

研究人員對一組大鼠進行游泳訓練，每天2次，持續進行4周。在最后一次訓練24小時后，大鼠心肌缺血30分鐘后再灌注24小時。發現與對照組相比，運動組大鼠表現出心肌梗死面積的減小和血清乳酸脫氫酶(LDH)水平的降低（乳酸脫氫酶主要存在于心肌細胞中，乳酸脫氫酶水平偏高，可以作為心肌受損的指標），表明4周的運動訓練可提供防止MI/R損傷的心肌保護。

2、長期運動的大鼠和人類血漿外泌體的表征和體外功能驗證

最后一次訓練24小時后，分離運動大鼠(Exe-exo)和久坐大鼠(Sed-exo)血漿中的外泌體。電鏡分析顯示直徑為30-100nm的典型圓形顆粒，Western blot證實外泌體標記蛋白（TSG101和CD81）的存在，并顯示Sed-exo和Exe-exo之間沒有顯著的差異。然后將這兩種外泌體分別與受損的心肌細胞共孵育，發現Exe-exo預孵育48小時后，H/R誘導的心肌細胞損傷減弱，如心肌細胞凋亡和LDH釋放減少，而Sed-exo卻沒有這種效果。

然后研究人員檢查了運動對人體循環外泌體的影響。招募了16名健康男學生運動員，讓他們進行1年以上的賽艇訓練（每天訓練1-2小時，每周6天）；同時招募16名未經訓練的男性對照學生。最后一次訓練課程24小時后采集血樣，收集賽艇運動員（Row-exo）或對照學生（Con-exo）血漿中的外泌體。同樣地，發現Row-exo預孵育減少了心肌細胞凋亡和LDH釋放并增加了心肌細胞活力。這些結果表明：運動衍生的血漿外泌體對H/R誘導的心肌細胞損傷發揮保護作用。

3、心肌內遞送運動衍生的循環外泌體可減少MI/R后的梗死面積并改善心功能

為了確定體內Exe-exo的心臟保護作用，將Exe-exo或 Sed-exo通過心肌內注射到大鼠中，48h后再進行MI/R。與對照大鼠相比，Exe-exo處理的大鼠表現出梗死面積的顯著減小，并伴隨著血清LDH的降低和心臟功能的改善。體內實驗表明了Exe-exo對MI/R損傷具有心臟保護作用。

4、miR-342-5p是Exe-exo誘導的心臟保護作用的關鍵組分

為了探討miRNA(s)是否參與了Exe-exo誘導的心臟保護作用，研究人員通過miRNA-seq（外泌體miRNA建庫、miRNA-seq服務由銳博生物提供）?和qRT-PCR驗證在Exe-exo和Sed-exo中鑒定了12個差異表達的miRNAs。其中miR-342-5p是最有效的心臟保護分子，可顯著降低H/R作用下心肌細胞的凋亡，降低LDH的釋放，并增加細胞活力。并且發現學生運動員體內的外泌體miR-342-5p水平比未經訓練的對照組學生更高。

5、miR-342-5p通過靶向心肌細胞中的Caspase 9和Jnk2發揮抗凋亡作用

研究人員通過數據庫預測了miR-342-5p可能的靶基因，最后重點關注參與缺血/再灌注損傷和凋亡途徑的Caspase 3、Caspase 9 和Jnk2。研究發現miR-342-5p mimic/inhibitor可顯著減低/增加心肌細胞中Caspase 9和Jnk2蛋白水平，Caspase 3的表達則無顯著變化。螢光素酶報告基因實驗進一步驗證了Caspase 9和Jnk2的3’UTR中miR-342-5p的結合位點。此外，miR-342-5p mimic與心肌細胞預孵育顯著抑制了H/R誘導的裂解的Caspase 3、裂解的Caspase 9和磷酸化(p-Jnk2 (Thr183/Tyr185)的增加。這些結果表明miR-342-5p通過靶向心肌細胞中的Caspase9和Jnk2發揮抗細胞凋亡作用。

6、miR-342-5p通過靶向Ppm1f增強心肌細胞Akt的磷酸化

生存信號Akt和Erk1/2作為心臟保護的關鍵分子已被廣泛報道。miR-342-5p mimic/inhibitor可提高/降低心肌細胞中Akt的磷酸化水平，而Erk1/2的磷酸化沒有顯著變化。在H/R處理的心肌細胞中也觀察到類似的結果。表明miR-342-5p可以激活心肌細胞中的促存活信號Akt。此外，研究人員發現Ppm1f是miR-342-5p潛在靶點中唯一的磷酸酶。miR-342-5p mimic/inhibitor可降低/增加心肌細胞中Ppm1f蛋白水平。螢光素酶報告基因實驗進一步證實了miR-342-5p直接靶向Ppm1f 3’UTR。值得注意的是，通過siRNA沉默下調Ppm1f蛋白表達不僅顯著提高了Akt磷酸化水平，而且還降低了由H/R誘導的心肌細胞凋亡，表明Akt磷酸化水平升高可能在miR-342-5p提供的心臟保護中發揮作用。

7、內皮細胞是運動誘導的外泌體miR-342-5p的主要來源

為了探索長期運動導致循環外泌體miR-342-5p增加的來源，研究人員檢測了miR-342-5p在大鼠不同部位中的表達。發現成熟miR-342-5p在多個組織中表達。經過4周游泳訓練，這些組織中miR-342-5p表達顯著升高，而這是由主動脈所導致的。進一步研究表明，主動脈內皮的去除顯著降低了運動大鼠主動脈中miR-342-5p水平，提示內皮細胞是主動脈中miR-342-5p的主要來源。研究發現長期運動也顯著增加了內皮細胞中miR-342-5p表達。此外，電鏡鑒定了內皮細胞胞漿中存在典型的多泡體(MVBs)，MVBs與質膜融合可釋放腔內外泌體進入循環。表明血管內皮細胞是運動誘導循環外體miR-342-5p升高的重要來源。

接下來，為了研究內皮細胞釋放的外泌體是否能被心肌細胞攝取。研究人員從轉染了Cy3標記的miRNA的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)條件培養基中分離出外泌體，然后加入到培養的人心肌細胞中。共聚焦成像證實了外泌體Cy3標記的miRNA從內皮細胞向心肌細胞的轉運，miR-342-5p在受體心肌細胞中的表達增加。更重要的是，受體心肌細胞在H/R后凋亡減少。這些結果表明內皮細胞釋放含有miR-342-5p的外泌體不僅能被心肌細胞所吸收，還能保護心肌細胞免受H/R損傷。

8、miR-342-5p在體內長期運動誘導的心臟保護中必不可少

為了探討miR-342-5p在體內運動誘導的心臟保護中的作用，研究人員在大鼠游泳訓練前一周通過心肌內注射AAV-anti-miR-342-5p或aav-陰性對照。發現運動訓練可增加心臟miR-342-5p，同時降低心肌Caspase 9、Jnk2和Ppm1f的表達，并且增加Akt磷酸化；AAV-anti-miR-342-5p處理可減弱這些變化。重要的是，在運動的MI/R大鼠中觀察到心肌梗塞面積和心肌細胞凋亡減少，這通過AAV-抗-miR-342-5p處理可顯著減弱這些變化。此外，在MI/R前48小時，miR-342-5p agomir（由銳博生物提供）治療顯著提高了大鼠心臟的miR-342-5p水平，并減少了心肌梗死面積。這些體內數據表明miR-342-5p在長期運動誘導的心肌保護中對MI/R損傷具有重要作用。