基因組穩(wěn)定性依賴于有絲分裂和胞質(zhì)分裂的適當(dāng)協(xié)調(diào)，其中動態(tài)微管捕獲并如實(shí)將染色體分離到子細(xì)胞。英國倫敦大學(xué)瑪麗皇后學(xué)院Lovorka Stojic研究組聯(lián)合劍橋大學(xué)Fanni Gergely及Duncan T. Odom研究組通過靶向2000多個人類lncRNAs的高內(nèi)涵RNAi成像篩選，鑒定了許多參與細(xì)胞分裂關(guān)鍵步驟的lncRNAs，如染色體分離、有絲分裂持續(xù)時間和胞質(zhì)分裂。并揭示了與基因組穩(wěn)定性有關(guān)的幾種lncRNAs，以及控制微管行為并具有細(xì)胞分裂以外功能的lncRNA，相關(guān)研究成果已發(fā)表在Nature Communications期刊上！
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原文題目：A high-content RNAi screen reveals multiple roles for long noncoding RNAs in cell division
接下來，就一起來看看本文是如何通過高內(nèi)涵細(xì)胞成像篩選+siRNA文庫的方法挖掘出一篇IF12+的文章吧！文章通過高內(nèi)涵RNAi篩選鑒定出多個在細(xì)胞分裂中具有重要功能的候選lncRNAs，然后選擇在有絲分裂進(jìn)程中發(fā)揮重要功能的linc00899和C1QTNF1-AS1，特別是linc00899作為目標(biāo)分子開展了一系列分子表征、功能及機(jī)制研究。
???高內(nèi)涵RNAi篩選鑒定細(xì)胞分裂中的lncRNAs
為了鑒定參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的lncRNAs，研究人員進(jìn)行了兩次連續(xù)的RNAi篩選（篩選A和B），即將靶向2231個人類lncRNAs的siRNA文庫轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，并使用高內(nèi)涵篩選有絲分裂表型以檢查其效果。
篩選A中，使用了靶向CEP215（標(biāo)記中心體）、α-微管蛋白（標(biāo)記微管細(xì)胞骨架）、鬼筆環(huán)肽（標(biāo)記肌動蛋白細(xì)胞骨架）和Hoechst（標(biāo)記細(xì)胞核）的抗體。
篩選B中，使用了磷酸化組蛋白H3（PHH3；專門標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞）、α-微管蛋白、γ-微管蛋白（標(biāo)記中心體）和Hoechst。
然后將這兩種篩選作為獨(dú)立的方法鑒定出在有絲分裂進(jìn)程（如linc00899、C1QTNF1-AS1）、染色體分離（如PP7080、linc00883）和胞質(zhì)分裂（如linc00840、loc729970）中具有重要功能的候選lncRNAs。
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Fig1. 鑒定參與細(xì)胞分裂調(diào)控的lncRNAs
linc00899和C1QTNF1-AS1的分子特征
研究人員選擇了兩個與延遲有絲分裂進(jìn)展相關(guān)的lncRNA linc00899和C1QTNF1-AS1進(jìn)行深入的功能分析。發(fā)現(xiàn)這兩個lncRNAs均在GENCODE中被注釋，顯示出活躍的轉(zhuǎn)錄跡象。此外，C1QTNF1-AS1是一個跨小鼠和人類保守的lncRNA，而linc00899在其5’端包含短的保守延伸，代表可能的功能域。RNA FISH實(shí)驗(yàn)顯示linc00899和C1QTNF1-AS1同時存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。對不同細(xì)胞部位提取的RNA進(jìn)行qRT-PCR分析顯示linc00899（而非C1QTNF1-AS1）與染色質(zhì)相關(guān)。
Fig2. linc00899和C1QTNF1-AS1 lncRNA的分子特征
Linc00899和C1QTNF1-AS1促進(jìn)及時的有絲分裂進(jìn)程
為了進(jìn)一步表征有絲分裂表型，研究人員刪除了HeLa和HeLa Kyoto細(xì)胞中的linc00899和C1QTNF1-AS1，檢測對有絲分裂進(jìn)程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)刪除lncRNA增加了細(xì)胞有絲分裂指數(shù)，對照組細(xì)胞在40±10分鐘開始后期，而linc00899和C1QTNF1-AS1缺失的細(xì)胞分別在100±173和240±146分鐘開始后期。此外，在少數(shù)linc00899缺失的細(xì)胞中可以檢測到靠近紡錘極的未對齊染色體（并且顯示延遲> 4 h），但在大多數(shù)細(xì)胞中，雙極紡錘體的形成和染色體集合以正常的動力學(xué)發(fā)生，并且細(xì)胞在中期到后期的過渡中表現(xiàn)出延遲；相比之下，幾乎所有C1QTNF1-AS1缺失的細(xì)胞均顯示染色體集合到中期板的受損。表明linc00899和C1QTNF1-AS1在調(diào)控有絲分裂進(jìn)程中具有生物學(xué)功能，盡管通過不同的機(jī)制。
Fig3. Linc00899和C1QTNF1-AS1通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)有絲分裂
有絲分裂進(jìn)程中TPPP的linc00899依賴性調(diào)控
為了揭示linc00899和C1QTNF1-AS1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，研究人員對RNAi和LNA介導(dǎo)lncRNA缺失細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq。對于C1QTNF1-AS1，只檢測到單個DEG（即C1QTNF1-AS1本身），這個結(jié)果反駁了C1QTNF1-AS1的轉(zhuǎn)錄作用，表明其在有絲分裂進(jìn)程中的功能可能依賴于C1QTNF1-AS1蛋白相互作用體。對于linc00899，在兩種LOF方法中確定了8個共同的DEGs，其中4個在兩種方法中變化方向相同。由于無法在mRNA和蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證RAI14、DNAAF5和ITGB1BP1的表達(dá)變化，因此研究人員重點(diǎn)關(guān)注了TPPP/p25。
Fig4. 通過RNA-seq檢測RNAi和LNA介導(dǎo)的linc00899和C1QTNF1-AS1缺失細(xì)胞中DEGs的Venn圖和熱圖
TPPP/p25是一種微管蛋白聚合促進(jìn)蛋白，在微管動力學(xué)和有絲分裂中具有確定的作用。研究發(fā)現(xiàn)linc00899的缺失會導(dǎo)致TPP的上調(diào)。那么，TPPP水平的增加是否是導(dǎo)致linc00899缺失細(xì)胞有絲分裂延遲的原因呢？對此，研究人員對linc00899和TPPP進(jìn)行了單敲低和雙敲低實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)敲低TPPP并不影響有絲分裂的時間，單獨(dú)缺失linc00899會導(dǎo)致有絲分裂的延遲。但是，同時缺失linc00899和TPPP的細(xì)胞，有絲分裂以接近正常的時間進(jìn)行。表明linc00899需要消耗至少50%才能實(shí)現(xiàn)TPPP上調(diào)和有絲分裂延遲。
Fig5. TPPP是linc00899調(diào)控有絲分裂的靶點(diǎn)
Linc00899控制紡錘體中的微管動力學(xué)
已知TPPP定位于有絲分裂紡錘體，其過表達(dá)可增加微管蛋白乙酰化，影響哺乳動物細(xì)胞中的微管動力學(xué)和穩(wěn)定性。因此，研究人員猜測linc00899缺失導(dǎo)致的TPPP上調(diào)是否也有類似的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)linc00899缺失細(xì)胞乙酰化α-微管蛋白水平顯著升高，這與linc00899缺失細(xì)胞具有更持久的微管相一致。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)linc008999缺失對乙酰化α-微管蛋白水平的影響與3 nM紫杉醇（在納摩爾劑量下可抑制微管動力學(xué)）的影響相當(dāng)，暗示linc008999缺失細(xì)胞中微管動力學(xué)受損。
Fig6. linc00899缺失導(dǎo)致更持久的有絲分裂微管
EB1蛋白與生長的微管正末端相關(guān)，并調(diào)節(jié)微管動力學(xué)。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)linc00899缺失導(dǎo)致EB1染色強(qiáng)度大大降低。有絲分裂細(xì)胞中EB1信號的定量證實(shí)了EB1水平的下降，表明linc00899缺失減少了生長的微管末端數(shù)量，這一表型與微管動力學(xué)的減少相一致。
Fig7. 免疫熒光檢測linc00899缺失HeLa細(xì)胞中的EB1信號
為了深入了解為什么linc00899和C1QTNF1-AS1缺失會導(dǎo)致有絲分裂延遲，研究人員檢測了缺失這些lncRNAs的HeLa細(xì)胞中著絲粒（CREST）和紡錘體（α-微管蛋白）標(biāo)志物的分布。發(fā)現(xiàn)約20%的linc00899缺失有絲分裂細(xì)胞顯示出較窄的中期板，在兩極附近有單個未附著的著絲粒對；中板集合缺陷在C1QTNF1-AS1缺失細(xì)胞中顯得更為嚴(yán)重，表現(xiàn)出非常寬的中期板，在兩個紡錘極周圍都有幾簇染色體。此外，在linc00899缺失細(xì)胞中，中板集合缺陷染色體導(dǎo)致的SAC（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)，確保后期開始之前每條染色體在中期板上是雙向的）活化有助于有絲分裂延遲。并且linc00899缺失會導(dǎo)致著絲粒對總體張力的下降。
Fig8. linc00899缺失導(dǎo)致中板集合缺陷
總之，以上研究結(jié)果表明linc00899缺失抑制了微管動力學(xué)，導(dǎo)致染色體中板集合缺陷并降低了中期板上的張力。這些缺陷有望阻止SAC的及時失活，從而延遲后期的開始。
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Linc00899在多種細(xì)胞系中調(diào)控TPPP和有絲分裂
接下來，研究人員發(fā)現(xiàn)除HeLa以外，RNAi介導(dǎo)的linc00899缺失導(dǎo)致了三個正常二倍體細(xì)胞系（hTERT-RPE1、MCF10A、HUVEC）中的TPPP上調(diào)；敲低linc00899后，TPPP水平升高，有絲分裂延遲8~16min。表明linc00899可在多細(xì)胞系中通過控制TPPP水平來調(diào)控有絲分裂進(jìn)程。
Fig9. Linc00899在不同細(xì)胞系中調(diào)節(jié)TPPP和有絲分裂進(jìn)程
linc00899的功能獲得性與挽救研究
為了闡明linc00899調(diào)控TPPP的作用模式，研究人員比較了異位和內(nèi)源性過表達(dá)linc00899對TPPP水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)異位過表達(dá)linc00899盡管增加了linc00899的表達(dá)量，但在HeLa和RPE1細(xì)胞中未觀察到TPPP水平的變化。表明linc00899不太可能反式調(diào)節(jié)TPPP。挽救實(shí)驗(yàn)也表明linc00899缺失后表達(dá)質(zhì)粒無法降低TPPP水平。內(nèi)源性過表達(dá)linc00899導(dǎo)致了正常二倍體RPE1中TPPP的下調(diào)，表明linc00899需要從其自身的位點(diǎn)表達(dá)才能抑制TPPP的表達(dá)。
Fig10. linc00899的功能獲得性和挽救研究及其對TPPP表達(dá)的影響
Linc00899結(jié)合并調(diào)控TPPP的轉(zhuǎn)錄
linc00899是細(xì)胞核和染色質(zhì)富集的lncRNA，極有可能直接調(diào)控TPPP的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)linc00899缺失后，TPPP啟動子上的H3K4me3（活躍轉(zhuǎn)錄的標(biāo)志）水平增加。接下來，研究人員通過CHART-seq在TPPP的內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了一個顯著的linc00899結(jié)合位點(diǎn)，卻無法鑒定出與linc00899轉(zhuǎn)錄本序列互補(bǔ)的區(qū)域。因此，linc00899可能通過蛋白相互作用結(jié)合到TPPP位點(diǎn)，從而介導(dǎo)TPPP的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。最后，研究人員通過co-RNA FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)了linc00899作為TPPP的轉(zhuǎn)錄抑制因子。
Fig11. Linc00899結(jié)合并抑制TPPP的轉(zhuǎn)錄
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-14978-7
