基因組穩定性依賴于有絲分裂和胞質分裂的適當協調，其中動態微管捕獲并如實將染色體分離到子細胞。英國倫敦大學瑪麗皇后學院Lovorka Stojic研究組聯合劍橋大學Fanni Gergely及Duncan T. Odom研究組通過靶向2000多個人類lncRNAs的高內涵RNAi成像篩選，鑒定了許多參與細胞分裂關鍵步驟的lncRNAs，如染色體分離、有絲分裂持續時間和胞質分裂。并揭示了與基因組穩定性有關的幾種lncRNAs，以及控制微管行為并具有細胞分裂以外功能的lncRNA，相關研究成果已發表在Nature Communications期刊上！
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原文題目：A high-content RNAi screen reveals multiple roles for long noncoding RNAs in cell division
接下來，就一起來看看本文是如何通過高內涵細胞成像篩選+siRNA文庫的方法挖掘出一篇IF12+的文章吧！文章通過高內涵RNAi篩選鑒定出多個在細胞分裂中具有重要功能的候選lncRNAs，然后選擇在有絲分裂進程中發揮重要功能的linc00899和C1QTNF1-AS1，特別是linc00899作為目標分子開展了一系列分子表征、功能及機制研究。
???高內涵RNAi篩選鑒定細胞分裂中的lncRNAs
為了鑒定參與調節細胞分裂的lncRNAs，研究人員進行了兩次連續的RNAi篩選（篩選A和B），即將靶向2231個人類lncRNAs的siRNA文庫轉染HeLa細胞，并使用高內涵篩選有絲分裂表型以檢查其效果。
篩選A中，使用了靶向CEP215（標記中心體）、α-微管蛋白（標記微管細胞骨架）、鬼筆環肽（標記肌動蛋白細胞骨架）和Hoechst（標記細胞核）的抗體。
篩選B中，使用了磷酸化組蛋白H3（PHH3；專門標記有絲分裂細胞）、α-微管蛋白、γ-微管蛋白（標記中心體）和Hoechst。
然后將這兩種篩選作為獨立的方法鑒定出在有絲分裂進程（如linc00899、C1QTNF1-AS1）、染色體分離（如PP7080、linc00883）和胞質分裂（如linc00840、loc729970）中具有重要功能的候選lncRNAs。
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Fig1. 鑒定參與細胞分裂調控的lncRNAs
linc00899和C1QTNF1-AS1的分子特征
研究人員選擇了兩個與延遲有絲分裂進展相關的lncRNA linc00899和C1QTNF1-AS1進行深入的功能分析。發現這兩個lncRNAs均在GENCODE中被注釋，顯示出活躍的轉錄跡象。此外，C1QTNF1-AS1是一個跨小鼠和人類保守的lncRNA，而linc00899在其5’端包含短的保守延伸，代表可能的功能域。RNA FISH實驗顯示linc00899和C1QTNF1-AS1同時存在于細胞核和細胞質中。對不同細胞部位提取的RNA進行qRT-PCR分析顯示linc00899（而非C1QTNF1-AS1）與染色質相關。
Fig2. linc00899和C1QTNF1-AS1 lncRNA的分子特征
Linc00899和C1QTNF1-AS1促進及時的有絲分裂進程
為了進一步表征有絲分裂表型，研究人員刪除了HeLa和HeLa Kyoto細胞中的linc00899和C1QTNF1-AS1，檢測對有絲分裂進程的影響。結果發現刪除lncRNA增加了細胞有絲分裂指數，對照組細胞在40±10分鐘開始后期，而linc00899和C1QTNF1-AS1缺失的細胞分別在100±173和240±146分鐘開始后期。此外，在少數linc00899缺失的細胞中可以檢測到靠近紡錘極的未對齊染色體（并且顯示延遲> 4 h），但在大多數細胞中，雙極紡錘體的形成和染色體集合以正常的動力學發生，并且細胞在中期到后期的過渡中表現出延遲；相比之下，幾乎所有C1QTNF1-AS1缺失的細胞均顯示染色體集合到中期板的受損。表明linc00899和C1QTNF1-AS1在調控有絲分裂進程中具有生物學功能，盡管通過不同的機制。
Fig3. Linc00899和C1QTNF1-AS1通過不同的機制調節有絲分裂
有絲分裂進程中TPPP的linc00899依賴性調控
為了揭示linc00899和C1QTNF1-AS1的轉錄調控功能，研究人員對RNAi和LNA介導lncRNA缺失細胞進行了RNA-seq。對于C1QTNF1-AS1，只檢測到單個DEG（即C1QTNF1-AS1本身），這個結果反駁了C1QTNF1-AS1的轉錄作用，表明其在有絲分裂進程中的功能可能依賴于C1QTNF1-AS1蛋白相互作用體。對于linc00899，在兩種LOF方法中確定了8個共同的DEGs，其中4個在兩種方法中變化方向相同。由于無法在mRNA和蛋白質水平上驗證RAI14、DNAAF5和ITGB1BP1的表達變化，因此研究人員重點關注了TPPP/p25。
Fig4. 通過RNA-seq檢測RNAi和LNA介導的linc00899和C1QTNF1-AS1缺失細胞中DEGs的Venn圖和熱圖
TPPP/p25是一種微管蛋白聚合促進蛋白，在微管動力學和有絲分裂中具有確定的作用。研究發現linc00899的缺失會導致TPP的上調。那么，TPPP水平的增加是否是導致linc00899缺失細胞有絲分裂延遲的原因呢？對此，研究人員對linc00899和TPPP進行了單敲低和雙敲低實驗，發現單獨敲低TPPP并不影響有絲分裂的時間，單獨缺失linc00899會導致有絲分裂的延遲。但是，同時缺失linc00899和TPPP的細胞，有絲分裂以接近正常的時間進行。表明linc00899需要消耗至少50%才能實現TPPP上調和有絲分裂延遲。
Fig5. TPPP是linc00899調控有絲分裂的靶點
Linc00899控制紡錘體中的微管動力學
已知TPPP定位于有絲分裂紡錘體，其過表達可增加微管蛋白乙酰化，影響哺乳動物細胞中的微管動力學和穩定性。因此，研究人員猜測linc00899缺失導致的TPPP上調是否也有類似的效果。結果發現linc00899缺失細胞乙酰化α-微管蛋白水平顯著升高，這與linc00899缺失細胞具有更持久的微管相一致。此外，研究人員發現linc008999缺失對乙酰化α-微管蛋白水平的影響與3 nM紫杉醇（在納摩爾劑量下可抑制微管動力學）的影響相當，暗示linc008999缺失細胞中微管動力學受損。
Fig6. linc00899缺失導致更持久的有絲分裂微管
EB1蛋白與生長的微管正末端相關，并調節微管動力學。免疫熒光檢測發現linc00899缺失導致EB1染色強度大大降低。有絲分裂細胞中EB1信號的定量證實了EB1水平的下降，表明linc00899缺失減少了生長的微管末端數量，這一表型與微管動力學的減少相一致。
Fig7. 免疫熒光檢測linc00899缺失HeLa細胞中的EB1信號
為了深入了解為什么linc00899和C1QTNF1-AS1缺失會導致有絲分裂延遲，研究人員檢測了缺失這些lncRNAs的HeLa細胞中著絲粒（CREST）和紡錘體（α-微管蛋白）標志物的分布。發現約20%的linc00899缺失有絲分裂細胞顯示出較窄的中期板，在兩極附近有單個未附著的著絲粒對；中板集合缺陷在C1QTNF1-AS1缺失細胞中顯得更為嚴重，表現出非常寬的中期板，在兩個紡錘極周圍都有幾簇染色體。此外，在linc00899缺失細胞中，中板集合缺陷染色體導致的SAC（紡錘體組裝檢驗點，確保后期開始之前每條染色體在中期板上是雙向的）活化有助于有絲分裂延遲。并且linc00899缺失會導致著絲粒對總體張力的下降。
Fig8. linc00899缺失導致中板集合缺陷
總之，以上研究結果表明linc00899缺失抑制了微管動力學，導致染色體中板集合缺陷并降低了中期板上的張力。這些缺陷有望阻止SAC的及時失活，從而延遲后期的開始。
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Linc00899在多種細胞系中調控TPPP和有絲分裂
接下來，研究人員發現除HeLa以外，RNAi介導的linc00899缺失導致了三個正常二倍體細胞系（hTERT-RPE1、MCF10A、HUVEC）中的TPPP上調；敲低linc00899后，TPPP水平升高，有絲分裂延遲8~16min。表明linc00899可在多細胞系中通過控制TPPP水平來調控有絲分裂進程。
Fig9. Linc00899在不同細胞系中調節TPPP和有絲分裂進程
linc00899的功能獲得性與挽救研究
為了闡明linc00899調控TPPP的作用模式，研究人員比較了異位和內源性過表達linc00899對TPPP水平的影響。結果發現異位過表達linc00899盡管增加了linc00899的表達量，但在HeLa和RPE1細胞中未觀察到TPPP水平的變化。表明linc00899不太可能反式調節TPPP。挽救實驗也表明linc00899缺失后表達質粒無法降低TPPP水平。內源性過表達linc00899導致了正常二倍體RPE1中TPPP的下調，表明linc00899需要從其自身的位點表達才能抑制TPPP的表達。
Fig10. linc00899的功能獲得性和挽救研究及其對TPPP表達的影響
Linc00899結合并調控TPPP的轉錄
linc00899是細胞核和染色質富集的lncRNA，極有可能直接調控TPPP的轉錄。研究發現linc00899缺失后，TPPP啟動子上的H3K4me3（活躍轉錄的標志）水平增加。接下來，研究人員通過CHART-seq在TPPP的內含子中發現了一個顯著的linc00899結合位點，卻無法鑒定出與linc00899轉錄本序列互補的區域。因此，linc00899可能通過蛋白相互作用結合到TPPP位點，從而介導TPPP的轉錄上調。最后，研究人員通過co-RNA FISH實驗證實了linc00899作為TPPP的轉錄抑制因子。
Fig11. Linc00899結合并抑制TPPP的轉錄
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-14978-7
