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研究背景：特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種慢性、致命的肺部疾病，以肺實(shí)質(zhì)中進(jìn)行性和不可逆的異常基質(zhì)沉積為特征。肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)源于通過(guò)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化（FMT）的固有成纖維細(xì)胞，是肺纖維化中主要的膠原生成細(xì)胞。N6-甲基腺苷（m6A）修飾涉及多種生物過(guò)程。然而，m6A修飾在肺纖維化中的作用在很大程度上仍然未知。

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測(cè)序類型：MeRIP-Seq

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方法流程：

1. 取材：人正常肺組織樣本和IPF肺組織樣本

2. 建庫(kù)測(cè)序：從人肺組織中提取50μg RNA，然后將RNA化學(xué)片段化為大約100nt的片段并使用m6A抗體進(jìn)行免疫沉淀，免疫沉淀后純化甲基化RNA并進(jìn)行RNA測(cè)序

3. 生信分析：結(jié)合峰注釋及統(tǒng)計(jì)；peak富集度分析；m6A甲基化與表達(dá)值數(shù)據(jù)聯(lián)合分析；結(jié)合峰motif檢測(cè)；目的基因GO分析等

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主要結(jié)果：

1. 本研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在博來(lái)霉素（BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型、FMT衍生的肌成纖維細(xì)胞和IPF患者肺樣本中上調(diào)。METTL3可能是導(dǎo)致肺纖維化中RNA m6A修飾升高的原因。

2. 對(duì)正常和IPF肺樣本進(jìn)行MeRIP-Seq以確定肺纖維化過(guò)程中m6A介導(dǎo)的基因變化。

   結(jié)果顯示：

   ①GGAC是主要共同基序，m6A峰在編碼序列（CDS）中豐富，特別是在終止密碼子附近。此外，與對(duì)照組相比，IPF肺樣本的整體m6A修飾增加。正常和IPF肺樣本中m6A的分布模式相似，m6A峰主要富集在內(nèi)含子和外顯子區(qū)域。

   ②鑒定出111個(gè)超甲基化m6A峰，其mRNA轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)（111個(gè)，超上調(diào)）；100個(gè)低甲基化m6A峰，其mRNA轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)（44個(gè)，超上調(diào)）或下調(diào)（56個(gè)，超下調(diào)）。此外，還確定了275個(gè)超甲基化m6A峰（275/386，71.2%），其mRNA轉(zhuǎn)錄本沒(méi)有明顯變化。這些超甲基化m6A轉(zhuǎn)錄本的GO分析表明，少數(shù)基因與轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞粘附、GTPase活性、凋亡過(guò)程和鐵跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。

3. 通過(guò)沉默METTL3（甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3）降低m6A水平可抑制體外和體內(nèi)的FMT過(guò)程。

4. KCNH6參與了m6A調(diào)節(jié)的FMT過(guò)程。即m6A修飾以YTHDF1依賴性方式通過(guò)調(diào)節(jié)KCNH6的翻譯來(lái)調(diào)控其表達(dá)，從而調(diào)節(jié)肺FMT。

Fig1. 肺纖維化過(guò)程中m6A介導(dǎo)的基因變化

（Zhang J, et al.?Molecular Therapy, 2021.）

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研究背景：活化的Kupffer細(xì)胞（KC）分泌的TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1）促進(jìn)非酒精性脂肪性肝炎（NASH）向肝纖維化的進(jìn)展。N6-甲基腺苷（m6A）RNA修飾參與各種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，但它是否在活化的KCs中的TGF-β1上調(diào)中起作用仍然未知。

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測(cè)序類型：m6A-Seq

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方法流程：

1. 取材：LPS活化的KCs
2. 建庫(kù)測(cè)序：提取LPS活化的KCs中的RNA，然后使用m6A抗體進(jìn)行免疫沉淀，將免疫沉淀后的RNA用于構(gòu)建文庫(kù)及隨后的測(cè)序
3. 生信分析：結(jié)合峰檢測(cè)；結(jié)合峰注釋及統(tǒng)計(jì)；peak分布/富集度可視化分析；結(jié)合峰motif檢測(cè)；差異結(jié)合峰分析；目的基因GO和KEGG分析等。

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主要結(jié)果：

1. 本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠的血清脂多糖（LPS）濃度增加。
2. 在NASH大鼠肝臟和LPS激活的KCs中，TGF-β1上調(diào)與METTL3/METTL14上調(diào)和整體m6A高甲基化密切相關(guān)。NF-κB p65直接激活METTL3和METTL14基因的轉(zhuǎn)錄。
3. 通過(guò)MeRIP-seq測(cè)序闡明m6A高甲基化在LPS激活的KCs中的位點(diǎn)特異性分布。結(jié)果顯示在TGF-β1信使RNA（mRNA）的5’UTR上鑒定出LPS響應(yīng)的m6A峰。

   ①確定了2859個(gè)差異m6A峰，其中1273個(gè)在LPS處理后上調(diào)，1586個(gè)在LPS處理后下調(diào)。GGACU代表m6A修飾的高度富集的序列基序，m6A峰集中在翻譯起始密碼子和終止密碼子附近。

   ②5’UTR上的m6A峰顯示出最大的響應(yīng)，從喂食含有10%能量的脂肪對(duì)照飲食組的4.57%增加到LPS組的7.05%。GO分析顯示LPS響應(yīng)的m6A峰聚集在免疫和炎癥反應(yīng)中，KEGG通路分析顯示其特異性富集在NF-κB和TNF信號(hào)通路中。

4. LPS刺激的TGF-β1表達(dá)在METTL3/METTL14缺陷型KCs和髓系細(xì)胞特異性METTL14敲除小鼠中被消除。
5. TGF-β1 mRNA 5’UTR上m6A位點(diǎn)的突變阻斷了LPS誘導(dǎo)的熒光素酶報(bào)告基因活性的增加。

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研究背景：N6-甲基腺苷（m6A）是最豐富的mRNA修飾之一，尤其是在真核生物中，在哺乳動(dòng)物、植物甚至一些病毒中都有發(fā)現(xiàn)。雖然m6A修飾對(duì)許多生物過(guò)程的調(diào)控至關(guān)重要，但其在病毒-宿主相互作用中的確切作用在很大程度上仍然未知。

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測(cè)序類型：MeRIP-Seq

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方法流程：

1. 取材：EBV感染和未感染的鼻咽上皮細(xì)胞（NP460和HK1）

2. 建庫(kù)測(cè)序：提取感染后NP460和HK1中的總RNA，并純化mRNA，然后將mRNA片段化，使用anti-m6A抗體與片段化RNA孵育進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，將免疫沉淀后的RNA用于構(gòu)建文庫(kù)及隨后的測(cè)序

3. 生信分析：結(jié)合峰檢測(cè)；結(jié)合峰注釋及統(tǒng)計(jì)；peak分布/富集度可視化分析；差異結(jié)合峰分析；目的基因KEGG分析等。

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主要結(jié)果：

1. 本研究使用m6A免疫沉淀和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)Epstein-Barr病毒（EBV）感染降低了轉(zhuǎn)錄因子KLF4 mRNA的m6A修飾，隨后增加了其蛋白質(zhì)水平。

   ①HK1細(xì)胞中總共有6758個(gè)峰被下調(diào)，1157個(gè)峰被上調(diào)。NP460細(xì)胞中，總共有1935個(gè)峰被下調(diào)，947個(gè)峰被上調(diào)。兩種細(xì)胞系中均存在553個(gè)差異峰，其中68個(gè)顯示m6A水平增加，而485個(gè)顯示m6A水平降低，分別稱為高甲基化峰和低甲基化峰。

   ②EBV感染后，HK1和NP460細(xì)胞中共有607個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，504個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。KEG通路分析表明這些基因主要富集在NF-κB信號(hào)通路中。m6A水平和差異基因表達(dá)的組合分析顯示，EBV感染的HK1細(xì)胞和NP460細(xì)胞中分別有3231個(gè)和985個(gè)差異峰。

2. 機(jī)制上，EBV立即早期蛋白BZLF1與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的啟動(dòng)子相互作用，抑制其表達(dá)。隨后，METTL3的減少降低了KLF4 mRNA m6A修飾的水平，防止其被m6A閱讀器蛋白YTHDF2降解。結(jié)果，KLF4蛋白水平上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)EBV感染鼻咽上皮細(xì)胞。