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今天，小編整理了幾篇2021年客戶最新發表的MeRIP-seq測序文章，正在或即將從事m6A研究的各位小伙伴可以參考借鑒一下~~~
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客戶應用案例1
Molecular Therapy (IF11.454)丨m6A modification regulates lung fibroblast-to-myofibroblast transition through modulating KCNH6 mRNA translation
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研究背景：特發性肺纖維化（IPF）是一種慢性、致命的肺部疾病，以肺實質中進行性和不可逆的異常基質沉積為特征。肌成纖維細胞主要來源于通過成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化（FMT）的固有成纖維細胞，是肺纖維化中主要的膠原生成細胞。N6-甲基腺苷（m6A）修飾涉及多種生物過程。然而，m6A修飾在肺纖維化中的作用在很大程度上仍然未知。
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測序類型：MeRIP-Seq
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方法流程：
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取材：人正常肺組織樣本和IPF肺組織樣本
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建庫測序：從人肺組織中提取50μg RNA，然后將RNA化學片段化為大約100nt的片段并使用m6A抗體進行免疫沉淀，免疫沉淀后純化甲基化RNA并進行RNA測序
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生信分析：結合峰注釋及統計；peak富集度分析；m6A甲基化與表達值數據聯合分析；結合峰motif檢測；目的基因GO分析等
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主要結果：
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本研究發現m6A修飾在博來霉素（BLM）誘導的肺纖維化小鼠模型、FMT衍生的肌成纖維細胞和IPF患者肺樣本中上調。METTL3可能是導致肺纖維化中RNA m6A修飾升高的原因。
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對正常和IPF肺樣本進行MeRIP-Seq以確定肺纖維化過程中m6A介導的基因變化。
結果顯示：
①GGAC是主要共同基序，m6A峰在編碼序列（CDS）中豐富，特別是在終止密碼子附近。此外，與對照組相比，IPF肺樣本的整體m6A修飾增加。正常和IPF肺樣本中m6A的分布模式相似，m6A峰主要富集在內含子和外顯子區域。
②鑒定出111個超甲基化m6A峰，其mRNA轉錄本顯著上調（111個，超上調）；100個低甲基化m6A峰，其mRNA轉錄本顯著上調（44個，超上調）或下調（56個，超下調）。此外，還確定了275個超甲基化m6A峰（275/386，71.2%），其mRNA轉錄本沒有明顯變化。這些超甲基化m6A轉錄本的GO分析表明，少數基因與轉錄、細胞粘附、GTPase活性、凋亡過程和鐵跨膜轉運相關。
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通過沉默METTL3（甲基轉移酶樣蛋白3）降低m6A水平可抑制體外和體內的FMT過程。
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KCNH6參與了m6A調節的FMT過程。即m6A修飾以YTHDF1依賴性方式通過調節KCNH6的翻譯來調控其表達，從而調節肺FMT。
Fig1. 肺纖維化過程中m6A介導的基因變化
（Zhang J, et al.?Molecular Therapy, 2021.）
客戶應用案例2
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Molecular Therapy-Nucleic Acids (IF8.886)丨Essential role of ALKBH5-mediated RNA demethylation modification in bile acid-induced gastric intestinal metaplasia
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研究背景：膽汁酸反流和隨后的CDX2（尾型同源框轉錄因子2）激活有助于胃腸上皮化生（IM），這是胃癌的前兆；然而，這種現象背后的機制尚不清楚。
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測序類型：m6A-Seq
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方法流程：
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取材：對照或CDCA處理的GES-1細胞
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建庫測序：提取對照或CDCA處理的GES-1細胞中的RNA，然后使用m6A抗體進行免疫沉淀，并對m6A抗體免疫沉淀RNA進行質控，100ng RNA用于構建文庫及隨后的測序（PE150）
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生信分析：結合峰注釋及統計；peak富集度分析；結合峰motif檢測；差異結合峰分析；目的基因GO和KEGG分析等
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主要結果：
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本研究證實了ALKBH5（一種主要的RNA N6-腺苷去甲基化酶）是膽汁酸誘導的胃IM所必需的。
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通過m6A測序首次揭示了胃IM中的m6A修飾譜，并結合RNA測序確定ZNF333是ALKBH5的一個新的m6A靶點。
測序結果顯示在對照和CDCA處理的細胞中觀察到類似的總體m6A模式，分別鑒定了63093個和52188個m6A峰，總的m6A水平無顯著差異。與在對照組（49.6%）和處理組（39.0%）中觀察到的獨特峰相反，有11.4%的峰在兩組中都發現了。此外，GGAC（RRACH）的m6A共有基序在m6A位點內高度富集。由于ALKBH5是一種RNA去甲基化酶，本研究重點集中在減小的m6A峰，并在CDCA處理的GES-1細胞中發現了2994個峰被減少。
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ALKBH5可以使ZNF333 mRNA去甲基化，從而通過消除m6A-YTHDF2依賴性mRNA降解來增強ZNF333表達。
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ALKBH5通過靶向ZNF333/CYLD軸和激活NF-κB信號來激活CDX2和下游腸道標志物。反過來，經典NF-κB通路的關鍵轉錄因子p65增強了ALKBH5在細胞核中的轉錄活性，從而形成了一個正前饋回路。
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IM組織中的ALKBH5水平與 ZNF333和CDX2水平呈正相關，具有顯著的臨床相關性。
Fig2. 鑒定ALKBH5在膽汁酸誘導的胃IM中的潛在靶標
（Yue B, et al.?Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2021.）
客戶應用案例3
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Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology (IF9.224)丨METTL3/METTL14 Transactivation and m 6 A-Dependent TGF-β1 Translation in Activated Kupffer Cells
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研究背景：活化的Kupffer細胞（KC）分泌的TGF-β1（轉化生長因子β1）促進非酒精性脂肪性肝炎（NASH）向肝纖維化的進展。N6-甲基腺苷（m6A）RNA修飾參與各種細胞應激反應，但它是否在活化的KCs中的TGF-β1上調中起作用仍然未知。
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測序類型：m6A-Seq
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方法流程：
- 取材：LPS活化的KCs
- 建庫測序：提取LPS活化的KCs中的RNA，然后使用m6A抗體進行免疫沉淀，將免疫沉淀后的RNA用于構建文庫及隨后的測序
- 生信分析：結合峰檢測；結合峰注釋及統計；peak分布/富集度可視化分析；結合峰motif檢測；差異結合峰分析；目的基因GO和KEGG分析等。
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主要結果：
- 本研究發現高脂飲食誘導的NASH大鼠的血清脂多糖（LPS）濃度增加。
- 在NASH大鼠肝臟和LPS激活的KCs中，TGF-β1上調與METTL3/METTL14上調和整體m6A高甲基化密切相關。NF-κB p65直接激活METTL3和METTL14基因的轉錄。
- 通過MeRIP-seq測序闡明m6A高甲基化在LPS激活的KCs中的位點特異性分布。結果顯示在TGF-β1信使RNA（mRNA）的5’UTR上鑒定出LPS響應的m6A峰。
①確定了2859個差異m6A峰，其中1273個在LPS處理后上調，1586個在LPS處理后下調。GGACU代表m6A修飾的高度富集的序列基序，m6A峰集中在翻譯起始密碼子和終止密碼子附近。
②5’UTR上的m6A峰顯示出最大的響應，從喂食含有10%能量的脂肪對照飲食組的4.57%增加到LPS組的7.05%。GO分析顯示LPS響應的m6A峰聚集在免疫和炎癥反應中，KEGG通路分析顯示其特異性富集在NF-κB和TNF信號通路中。
- LPS刺激的TGF-β1表達在METTL3/METTL14缺陷型KCs和髓系細胞特異性METTL14敲除小鼠中被消除。
- TGF-β1 mRNA 5’UTR上m6A位點的突變阻斷了LPS誘導的熒光素酶報告基因活性的增加。
Fig3. 通過MeRIP-seq在KCs中比較了CON和LPS的m6A修飾
（Feng Y, et al.?Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology, 2021.）
客戶應用案例4
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Journal of Biological Chemistry（IF5.154）丨Identification of an N6-methyladenosine-mediated positive feedback loop that promotes Epstein-Barr virus infection
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研究背景：N6-甲基腺苷（m6A）是最豐富的mRNA修飾之一，尤其是在真核生物中，在哺乳動物、植物甚至一些病毒中都有發現。雖然m6A修飾對許多生物過程的調控至關重要，但其在病毒-宿主相互作用中的確切作用在很大程度上仍然未知。
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測序類型：MeRIP-Seq
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方法流程：
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取材：EBV感染和未感染的鼻咽上皮細胞（NP460和HK1）
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建庫測序：提取感染后NP460和HK1中的總RNA，并純化mRNA，然后將mRNA片段化，使用anti-m6A抗體與片段化RNA孵育進行免疫沉淀反應，將免疫沉淀后的RNA用于構建文庫及隨后的測序
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生信分析：結合峰檢測；結合峰注釋及統計；peak分布/富集度可視化分析；差異結合峰分析；目的基因KEGG分析等。
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主要結果：
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本研究使用m6A免疫沉淀和測序，發現Epstein-Barr病毒（EBV）感染降低了轉錄因子KLF4 mRNA的m6A修飾，隨后增加了其蛋白質水平。
①HK1細胞中總共有6758個峰被下調，1157個峰被上調。NP460細胞中，總共有1935個峰被下調，947個峰被上調。兩種細胞系中均存在553個差異峰，其中68個顯示m6A水平增加，而485個顯示m6A水平降低，分別稱為高甲基化峰和低甲基化峰。
②EBV感染后，HK1和NP460細胞中共有607個基因表達下調，504個基因表達上調。KEG通路分析表明這些基因主要富集在NF-κB信號通路中。m6A水平和差異基因表達的組合分析顯示，EBV感染的HK1細胞和NP460細胞中分別有3231個和985個差異峰。
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機制上，EBV立即早期蛋白BZLF1與m6A甲基轉移酶METTL3的啟動子相互作用，抑制其表達。隨后，METTL3的減少降低了KLF4 mRNA m6A修飾的水平，防止其被m6A閱讀器蛋白YTHDF2降解。結果，KLF4蛋白水平上調，進而促進EBV感染鼻咽上皮細胞。
Fig4. EBV感染改變宿主基因的m6A修飾和RNA表達
（Dai D L, et al.?Journal of Biological Chemistry, 2021.）
