摘? ?要?

將EU（5-ethynyluridine）標記的新轉(zhuǎn)錄RNAs與結合蛋白的表征相結合的方法稱為RICK（利用點擊化學捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用組），該方法可系統(tǒng)地捕獲與許多各種不同RNAs（包括新生RNAs和傳統(tǒng)上被忽略的非polyA RNAs）結合的蛋白。RICK已經(jīng)確定了對非polyA RNAs具有優(yōu)先親和力的其他新型RNA結合蛋白中的有絲分裂調(diào)節(jié)因子，揭示了代謝酶/因子與新生RNAs之間的聯(lián)系，并擴展了小鼠胚胎干細胞（mESCs）的已知RNA結合蛋白質(zhì)組。RICK將促進對不同細胞和系統(tǒng)中總RNA結合蛋白質(zhì)組的深入研究。

研究背景

目前，系統(tǒng)描述RNA結合蛋白質(zhì)組（或RNA相互作用組）的方法主要是基于用oligo（dT）包被的磁珠捕獲聚腺苷酸化（polyA）RNA，主要是mRNA。然而，polyA尾僅在其加工過程中被添加到新轉(zhuǎn)錄的RNAs中成為成熟的形式，而一些成熟的mRNAs是非polyA或bimorphic（二態(tài)）。而且，成熟的非polyA RNA種類包含全部轉(zhuǎn)錄序列相當大的一部分。考慮可以捕獲與所有類型RNAs相互作用的RNA結合蛋白（RBPs）的方法學不僅能夠擴展對RNA相互作用組的現(xiàn)有觀點，而且還有助于理解非polyA RNAs在生理學和疾病中的功能。研究者基于使用點擊反應將EU標記的RNAs和生物素進行鏈接，開發(fā)了一種通用方法來捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用組。

研究路線??

1、設計RICK技術，用于捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用組：EU、凝膠電泳、銀染、pull-down、western blotting等
2、鑒定RICK捕獲的RNA種類：RNA-seq、RT-qPCR等
3、RICK分離的蛋白質(zhì)的特征及功能分析：LC-MS/MS、western blotting、GO及KEGG通路分析等
4、RICK鑒定優(yōu)先結合非polyA RNAs的蛋白質(zhì)：RT-PCR、LC-MS/MS、western blotting等
5、與METTL1和CDK1相互作用的RNAs的表征：PAR-CLIP測序、RIP-qPCR等
6、RICK捕獲新生RNA相互作用組：EU、GO及KEGG通路分析等
7、RICK捕獲mESCs的總RNA相互作用組：EU、LC-MS/MS等

研究結果??

1）??使用RICK捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用組

研究者首先用EU標記HeLa細胞中的RNA(16h)，然后使用254nm UV將RNA與蛋白進行交聯(lián)，并使用點擊反應對EU進行生物素化。接下來，通過鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠提取EU標記的RNA-蛋白質(zhì)復合物（圖1）。凝膠電泳和銀染確認RICK成功分離出與EU標記的RNA直接相互作用的蛋白質(zhì)。當樣品未交聯(lián)或與RNase共處理時，蛋白質(zhì)pull-down信號丟失，證實pull-down的特異性。western blotting驗證了RICK對已知RBPs的捕獲。因此，使用新建立的RICK可特異性分離與新轉(zhuǎn)錄RNA相互作用的蛋白質(zhì)。

2）??測定RICK捕獲的RNA種類

對RICK pull-down樣本進行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)與oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)存在明顯差異（圖2a）。接著，研究了RICK樣本中3種相關的非polyA RNA種類：環(huán)狀RNAs（circRNAs）、近端啟動子RNAs（ppRNAs）和增強子RNAs（eRNAs）。與oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)相比，在RICK樣本中觀察到6199個反向剪接事件（暗示為circRNAs），其中828個與circBase數(shù)據(jù)集重疊。另外，轉(zhuǎn)錄暫停基因（RNA Pol II Traveling Ratio/TR>4）在TSS周圍顯示出更高的RNA-seq信號積累，表明僅通過RICK可有效分離ppRNAs，而對于非暫停基因（TR<4）則差異很小（圖2bc）。此外，通過RICK樣品中假定的增強子區(qū)域還觀察到強烈富集的RNA-seq信號（提示為eRNAs），而不是oligo（dT）捕獲（圖2d）。定量RT-PCR驗證RICK提取的非polyA RNAs，發(fā)現(xiàn)oligo（dT）捕獲樣品中相同的RNA較少富集或不存在（圖2e）。研究顯示，RICK成功地分離了不限于polyA RNAs的各種各樣RNA種類，表明它也可以富集oligo（dT）捕獲方法不能分離的RBPs。

3）???表征RICK分離的蛋白質(zhì)

對RICK分離的蛋白進行LC-MS/MS分析，發(fā)現(xiàn)1353種蛋白質(zhì)，其中720種高置信度蛋白，633種低置信度蛋白。與oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)相比，RICK樣本中存在344種RICK獨有的RBPs。

然后，在EU存在的情況下進行oligo（dT）捕獲，以評估其摻入是否影響RNA-蛋白質(zhì)相互作用。聚類分析發(fā)現(xiàn)EU+和EU- oligo（dT）捕獲樣品彼此之間高度相關，但與RICK樣品相關性不大（圖3a）。EU+ oligo（dT）捕獲樣品有469種高置信度蛋白，僅有2種在344種RICK獨有的RBPs之中。

將344種RICK獨有的RBPs與3個報道的人oligo（dT）捕獲研究進行比較，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)這些蛋白質(zhì)（295，85.8％）對于RICK來說確實是獨特的（圖3b）。Western blotting證實了幾個RICK獨有的RBPs（如有絲分裂調(diào)節(jié)因子CDK1和m7G甲基轉(zhuǎn)移酶METTL1）確實是由RICK沉淀。典型的RBPs則存在于兩種方法的樣品中。

結果表明，RICK可分離出oligo（dT）捕獲研究中未鑒定的許多蛋白質(zhì)，這些差異既不是由細胞培養(yǎng)、蛋白質(zhì)組學程序的變化引起的，也不是由EU標記引入的。

4）??RICK分離的蛋白質(zhì)的功能分析

對295個RICK獨特的RBPs進行GO分析，發(fā)現(xiàn)與有絲分裂有關的生物過程的富集（圖4a）。KEGG通路分析顯示前十個最顯著富集途徑中還包括“細胞周期”（圖4b）。

5）??RICK鑒定優(yōu)先結合非polyA RNAs的蛋白

首先研究者在標準RICK方法中添加了另一個步驟，即連續(xù)三輪與oligo（dT）包被的磁珠孵育以有效去除polyA RNAs，并通過RT-PCR得到驗證。LC-MS/MS鑒定出914種高置信度蛋白質(zhì)，稱為’polyA耗盡的RICK蛋白質(zhì)’。其中，576種與標準RICK程序的720種高置信度蛋白質(zhì)重疊（圖5a）。進一步分析顯示295種RICK獨特RBPs中的204種（69.2%）與914種polyA耗盡的RICK蛋白質(zhì)重疊。另一方面，在不與RICK獨特的RBPs重疊的710種polyA耗盡的RICK蛋白中，563種存在于oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)集中（圖5b），說明這些蛋白具有結合polyA和非polyA RNA的混合傾向。western blotting證實polyA RNA去除之后RICK鑒定的RBPs（包括CDK1和METTL1）仍然富集。表明RICK可用于鑒定優(yōu)先結合非polyA RNAs的蛋白質(zhì)。

6）??與METTL1和CDK1相互作用的RNAs

研究者選擇了兩個RICK獨特的RBPs（METTL1和CDK1），使用PAR-CLIP測序研究與它們相互作用的RNAs。分析顯示METTL1與捕獲的RNAs廣泛結合，并且與tRNAs顯著結合（31.8%）。同時還存在對多種可能的非polyA RNAs的結合，例如內(nèi)含子RNAs（5.9％）和從基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄的RNAs（未注釋為lincRNAs；1.7％）（圖6）。另外，37.8％的序列被映射到mRNAs，但這些映射序列可能對應于未成熟轉(zhuǎn)錄本、circRNAs或ppRNAs。

接下來，通過RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)METTL1與非polyA RNA VTRNA1-3相互作用。使用隨機六聚體引物可富集7種mRNAs，而使用oligo（dT）引物僅可相對擴增其中3種，支持了METTL1結合含有mRNA序列的非polyA RNAs（圖7d）。此外，分析METTL1的結合基序發(fā)現(xiàn)‘CUCUUCG’是2次重復實驗中最富集的結合基序（圖7e）。

對CDK1 PAR-CLIP測序數(shù)據(jù)進行分析得到相似結果。因此，METTL1和CDK1廣泛地與非polyA RNAs結合，暗示這兩種蛋白質(zhì)的RNA相關功能被忽視。

7）??RICK用于捕獲新生RNA相互作用組

對HeLa細胞進行短時間EU標記（0.5、1和2 h），以研究RICK是否可以豐富捕獲與新生RNAs相互作用的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)與16h RICK相比，由于摻入的EU較少，捕獲的RNAs和蛋白質(zhì)減少。短標記RICK中對應于5’UTR、CDS和3’UTR序列的百分比減少，表明成熟的mRNAs較少。

鑒定了208個不同的高置信度蛋白質(zhì)（0.5、1和2 h RICK分別鑒定149、119和143個高置信度蛋白質(zhì)），稱為新生富集的RBPs（圖8a）。208個新生富集的RBPs的GO和KEGG通路分析顯示了轉(zhuǎn)錄和RNA代謝過程的富集（圖8b）。進一步研究顯示，這208個新生富集的RBPs中只有43個未被oligo（dT）捕獲。這些發(fā)現(xiàn)表明新生的RNA轉(zhuǎn)錄
和局部代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系可調(diào)節(jié)表觀基因組和潛在的表觀轉(zhuǎn)錄組。

8） RICK捕獲mESCs的總RNA相互作用組

接下來，研究者旨在證明RICK可以應用于其他細胞類型。證實使用鏈霉親和素結合的辣根過氧化物酶在mESCs中可高效地摻入EU。鑒定出518個高置信度和304個低置信度蛋白質(zhì)，其中358個專屬于RICK，稱為RICK獨有的mESC RBPs。358個RICK獨有的mESC RBPs中有95個蛋白在mESCs中的表達水平更高，指出其在mESC自我更新或多能性中的潛在作用。因此，RICK可以應用于除HeLa以外的不同細胞類型；需要進一步的研究來確定新鑒定的候選RBPs在mESCs自我更新/多能性中的作用（圖9）。