摘? ?要?

將EU（5-ethynyluridine）標(biāo)記的新轉(zhuǎn)錄RNAs與結(jié)合蛋白的表征相結(jié)合的方法稱為RICK（利用點(diǎn)擊化學(xué)捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用組），該方法可系統(tǒng)地捕獲與許多各種不同RNAs（包括新生RNAs和傳統(tǒng)上被忽略的非polyA RNAs）結(jié)合的蛋白。RICK已經(jīng)確定了對(duì)非polyA RNAs具有優(yōu)先親和力的其他新型RNA結(jié)合蛋白中的有絲分裂調(diào)節(jié)因子，揭示了代謝酶/因子與新生RNAs之間的聯(lián)系，并擴(kuò)展了小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）的已知RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組。RICK將促進(jìn)對(duì)不同細(xì)胞和系統(tǒng)中總RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組的深入研究。

研究背景

目前，系統(tǒng)描述RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組（或RNA相互作用組）的方法主要是基于用oligo（dT）包被的磁珠捕獲聚腺苷酸化（polyA）RNA，主要是mRNA。然而，polyA尾僅在其加工過程中被添加到新轉(zhuǎn)錄的RNAs中成為成熟的形式，而一些成熟的mRNAs是非polyA或bimorphic（二態(tài)）。而且，成熟的非polyA RNA種類包含全部轉(zhuǎn)錄序列相當(dāng)大的一部分?？紤]可以捕獲與所有類型RNAs相互作用的RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的方法學(xué)不僅能夠擴(kuò)展對(duì)RNA相互作用組的現(xiàn)有觀點(diǎn)，而且還有助于理解非polyA RNAs在生理學(xué)和疾病中的功能。研究者基于使用點(diǎn)擊反應(yīng)將EU標(biāo)記的RNAs和生物素進(jìn)行鏈接，開發(fā)了一種通用方法來捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用組。

研究路線??

1、設(shè)計(jì)RICK技術(shù)，用于捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用組：EU、凝膠電泳、銀染、pull-down、western blotting等
2、鑒定RICK捕獲的RNA種類：RNA-seq、RT-qPCR等
3、RICK分離的蛋白質(zhì)的特征及功能分析：LC-MS/MS、western blotting、GO及KEGG通路分析等
4、RICK鑒定優(yōu)先結(jié)合非polyA RNAs的蛋白質(zhì)：RT-PCR、LC-MS/MS、western blotting等
5、與METTL1和CDK1相互作用的RNAs的表征：PAR-CLIP測(cè)序、RIP-qPCR等
6、RICK捕獲新生RNA相互作用組：EU、GO及KEGG通路分析等
7、RICK捕獲mESCs的總RNA相互作用組：EU、LC-MS/MS等

研究結(jié)果??

1）??使用RICK捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA相互作用組

研究者首先用EU標(biāo)記HeLa細(xì)胞中的RNA(16h)，然后使用254nm UV將RNA與蛋白進(jìn)行交聯(lián)，并使用點(diǎn)擊反應(yīng)對(duì)EU進(jìn)行生物素化。接下來，通過鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠提取EU標(biāo)記的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物（圖1）。凝膠電泳和銀染確認(rèn)RICK成功分離出與EU標(biāo)記的RNA直接相互作用的蛋白質(zhì)。當(dāng)樣品未交聯(lián)或與RNase共處理時(shí)，蛋白質(zhì)pull-down信號(hào)丟失，證實(shí)pull-down的特異性。western blotting驗(yàn)證了RICK對(duì)已知RBPs的捕獲。因此，使用新建立的RICK可特異性分離與新轉(zhuǎn)錄RNA相互作用的蛋白質(zhì)。

2）??測(cè)定RICK捕獲的RNA種類

對(duì)RICK pull-down樣本進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)與oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)存在明顯差異（圖2a）。接著，研究了RICK樣本中3種相關(guān)的非polyA RNA種類：環(huán)狀RNAs（circRNAs）、近端啟動(dòng)子RNAs（ppRNAs）和增強(qiáng)子RNAs（eRNAs）。與oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)相比，在RICK樣本中觀察到6199個(gè)反向剪接事件（暗示為circRNAs），其中828個(gè)與circBase數(shù)據(jù)集重疊。另外，轉(zhuǎn)錄暫?；颍≧NA Pol II Traveling Ratio/TR>4）在TSS周圍顯示出更高的RNA-seq信號(hào)積累，表明僅通過RICK可有效分離ppRNAs，而對(duì)于非暫停基因（TR<4）則差異很?。▓D2bc）。此外，通過RICK樣品中假定的增強(qiáng)子區(qū)域還觀察到強(qiáng)烈富集的RNA-seq信號(hào)（提示為eRNAs），而不是oligo（dT）捕獲（圖2d）。定量RT-PCR驗(yàn)證RICK提取的非polyA RNAs，發(fā)現(xiàn)oligo（dT）捕獲樣品中相同的RNA較少富集或不存在（圖2e）。研究顯示，RICK成功地分離了不限于polyA RNAs的各種各樣RNA種類，表明它也可以富集oligo（dT）捕獲方法不能分離的RBPs。

3）???表征RICK分離的蛋白質(zhì)

對(duì)RICK分離的蛋白進(jìn)行LC-MS/MS分析，發(fā)現(xiàn)1353種蛋白質(zhì)，其中720種高置信度蛋白，633種低置信度蛋白。與oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)相比，RICK樣本中存在344種RICK獨(dú)有的RBPs。

然后，在EU存在的情況下進(jìn)行oligo（dT）捕獲，以評(píng)估其摻入是否影響RNA-蛋白質(zhì)相互作用。聚類分析發(fā)現(xiàn)EU+和EU- oligo（dT）捕獲樣品彼此之間高度相關(guān)，但與RICK樣品相關(guān)性不大（圖3a）。EU+ oligo（dT）捕獲樣品有469種高置信度蛋白，僅有2種在344種RICK獨(dú)有的RBPs之中。

將344種RICK獨(dú)有的RBPs與3個(gè)報(bào)道的人oligo（dT）捕獲研究進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)這些蛋白質(zhì)（295，85.8％）對(duì)于RICK來說確實(shí)是獨(dú)特的（圖3b）。Western blotting證實(shí)了幾個(gè)RICK獨(dú)有的RBPs（如有絲分裂調(diào)節(jié)因子CDK1和m7G甲基轉(zhuǎn)移酶METTL1）確實(shí)是由RICK沉淀。典型的RBPs則存在于兩種方法的樣品中。

結(jié)果表明，RICK可分離出oligo（dT）捕獲研究中未鑒定的許多蛋白質(zhì)，這些差異既不是由細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白質(zhì)組學(xué)程序的變化引起的，也不是由EU標(biāo)記引入的。

4）??RICK分離的蛋白質(zhì)的功能分析

對(duì)295個(gè)RICK獨(dú)特的RBPs進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)與有絲分裂有關(guān)的生物過程的富集（圖4a）。KEGG通路分析顯示前十個(gè)最顯著富集途徑中還包括“細(xì)胞周期”（圖4b）。

5）??RICK鑒定優(yōu)先結(jié)合非polyA RNAs的蛋白

首先研究者在標(biāo)準(zhǔn)RICK方法中添加了另一個(gè)步驟，即連續(xù)三輪與oligo（dT）包被的磁珠孵育以有效去除polyA RNAs，并通過RT-PCR得到驗(yàn)證。LC-MS/MS鑒定出914種高置信度蛋白質(zhì)，稱為’polyA耗盡的RICK蛋白質(zhì)’。其中，576種與標(biāo)準(zhǔn)RICK程序的720種高置信度蛋白質(zhì)重疊（圖5a）。進(jìn)一步分析顯示295種RICK獨(dú)特RBPs中的204種（69.2%）與914種polyA耗盡的RICK蛋白質(zhì)重疊。另一方面，在不與RICK獨(dú)特的RBPs重疊的710種polyA耗盡的RICK蛋白中，563種存在于oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)集中（圖5b），說明這些蛋白具有結(jié)合polyA和非polyA RNA的混合傾向。western blotting證實(shí)polyA RNA去除之后RICK鑒定的RBPs（包括CDK1和METTL1）仍然富集。表明RICK可用于鑒定優(yōu)先結(jié)合非polyA RNAs的蛋白質(zhì)。

6）??與METTL1和CDK1相互作用的RNAs

研究者選擇了兩個(gè)RICK獨(dú)特的RBPs（METTL1和CDK1），使用PAR-CLIP測(cè)序研究與它們相互作用的RNAs。分析顯示METTL1與捕獲的RNAs廣泛結(jié)合，并且與tRNAs顯著結(jié)合（31.8%）。同時(shí)還存在對(duì)多種可能的非polyA RNAs的結(jié)合，例如內(nèi)含子RNAs（5.9％）和從基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄的RNAs（未注釋為lincRNAs；1.7％）（圖6）。另外，37.8％的序列被映射到mRNAs，但這些映射序列可能對(duì)應(yīng)于未成熟轉(zhuǎn)錄本、circRNAs或ppRNAs。

接下來，通過RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)METTL1與非polyA RNA VTRNA1-3相互作用。使用隨機(jī)六聚體引物可富集7種mRNAs，而使用oligo（dT）引物僅可相對(duì)擴(kuò)增其中3種，支持了METTL1結(jié)合含有mRNA序列的非polyA RNAs（圖7d）。此外，分析METTL1的結(jié)合基序發(fā)現(xiàn)‘CUCUUCG’是2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中最富集的結(jié)合基序（圖7e）。

對(duì)CDK1 PAR-CLIP測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到相似結(jié)果。因此，METTL1和CDK1廣泛地與非polyA RNAs結(jié)合，暗示這兩種蛋白質(zhì)的RNA相關(guān)功能被忽視。

7）??RICK用于捕獲新生RNA相互作用組

對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間EU標(biāo)記（0.5、1和2 h），以研究RICK是否可以豐富捕獲與新生RNAs相互作用的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)與16h RICK相比，由于摻入的EU較少，捕獲的RNAs和蛋白質(zhì)減少。短標(biāo)記RICK中對(duì)應(yīng)于5’UTR、CDS和3’UTR序列的百分比減少，表明成熟的mRNAs較少。

鑒定了208個(gè)不同的高置信度蛋白質(zhì)（0.5、1和2 h RICK分別鑒定149、119和143個(gè)高置信度蛋白質(zhì)），稱為新生富集的RBPs（圖8a）。208個(gè)新生富集的RBPs的GO和KEGG通路分析顯示了轉(zhuǎn)錄和RNA代謝過程的富集（圖8b）。進(jìn)一步研究顯示，這208個(gè)新生富集的RBPs中只有43個(gè)未被oligo（dT）捕獲。這些發(fā)現(xiàn)表明新生的RNA轉(zhuǎn)錄
和局部代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系可調(diào)節(jié)表觀基因組和潛在的表觀轉(zhuǎn)錄組。

8） RICK捕獲mESCs的總RNA相互作用組

接下來，研究者旨在證明RICK可以應(yīng)用于其他細(xì)胞類型。證實(shí)使用鏈霉親和素結(jié)合的辣根過氧化物酶在mESCs中可高效地?fù)饺隕U。鑒定出518個(gè)高置信度和304個(gè)低置信度蛋白質(zhì)，其中358個(gè)專屬于RICK，稱為RICK獨(dú)有的mESC RBPs。358個(gè)RICK獨(dú)有的mESC RBPs中有95個(gè)蛋白在mESCs中的表達(dá)水平更高，指出其在mESC自我更新或多能性中的潛在作用。因此，RICK可以應(yīng)用于除HeLa以外的不同細(xì)胞類型；需要進(jìn)一步的研究來確定新鑒定的候選RBPs在mESCs自我更新/多能性中的作用（圖9）。