高通量測序樣品處理推薦流程

1.1 DNA樣品的處理

1.1.1 新鮮或冷凍保存組織：≥500mg/樣品。（注：不同類型的樣品產量差別較大，具體送樣量以達到DNA樣品要求為準。）

新鮮剝離樣品，快速清洗，分割

(1) 對于進行DNA提取的樣品，須置于無DNase器皿中，速凍存于-20℃以下。

提前冰上預冷生理鹽水或PBS；

從活體切取所需組織，置于冰上平皿內；加入預冷的生理鹽水或PBS至淹沒組織，漂洗去除血漬污物，重復1次；

用濾紙吸干樣品表面液滴，剪成約0.3cm左右的小塊；

液氮速凍后用封口膜封口（組織離體后至液氮速凍，操作時間不宜超過3min）。

(2) 運輸方式：干冰運輸或冷鏈運輸。

1.1.2 貼壁或懸浮細胞：≥1×107細胞/樣品。（注：不同類型的細胞產量差別較大，具體送樣量以達到DNA樣品要求為準。）

(1) 對于進行DNA提取的樣品，須速凍存于-20℃以下。冰上預冷PBS（器皿、移液器槍頭、離心管等無DNase）；

a) 貼壁細胞：用胰酶處理細胞后，進行離心收集，最后用預冷的PBS緩沖液洗滌一次，去除PBS，液氮速凍。

b) 懸浮細胞：離心收集細胞，棄培養液，用預冷PBS漂洗一次，液氮速凍。

液氮速凍后用封口膜封口。

(2) 運輸方式：干冰運輸或冷鏈運輸。

1.1.3 微生物：>50mg（注：不同類型的樣品產量差別較大，具體送樣量以達到質檢要求為準。）

(1) 建議選取處于對數生長期的菌液，高速離心收集菌體后，棄上清后菌體于液氮速凍后用封口膜封口。

(2) 運輸方式：干冰運輸或冷鏈運輸。

1.1.4 血液：>2ml （注：具體送樣量以達到DNA樣品要求為準。）

(1) 用EDTA抗凝管采集新鮮血液混勻，須速凍存于-20℃以下。

(2) 運輸方式：干冰運輸或冷鏈運輸。

注：推薦客戶分裝備份所有寄送樣品，以便用于樣品檢測不合格時分析原因。

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1.2 RNA樣品的處理

1.2.1 ≥350mg組織/樣品。（注：不同類型的樣品RNA產量差別較大，具體送樣量以達到質檢要求為準。）

新鮮剝離樣品，快速清洗，分割，

(1) 對于進行RNA提取的樣品，推薦處理方法如下：

提前冰上預冷生理鹽水或PBS（所用溶液需用DEPC處理過的水配制，器皿無DNase及RNase）；

從活體切取所需組織，置于冰上平皿內；加入預冷的生理鹽水或PBS至淹沒組織，漂洗去除血漬污物，重復1次；

用濾紙吸干樣品表面液滴，剪成約0.3cm左右的小塊；

a) 無保護液：剪碎的組織樣品直接液氮速凍用封口膜封口（組織離體后至液氮速凍，操作時間不宜超過3min）。

b) RNAlater：放入加有5倍體積RNAlater的離心管或凍存管中（RNAlater需在4°C下過夜以允許溶液滲透進組織）；液氮速凍后用封口膜封口（組織離體后至液氮速凍，操作時間不宜超過3min）。

(2) 運輸方式：干冰運輸。

1.2.2 貼壁或懸浮細胞：≥5×106細胞/樣品。（注：不同類型的細胞產量差別較大，具體送樣量以達到RNA樣品要求為準。）

(1) 對于進行RNA提取的樣品，推薦處理方法如下：

RNA提取操作前，將實驗器材高溫高壓滅菌，如果條件允許建議使用RNase清除劑仔細擦拭超凈臺臺面、操作器材表面，清除外源性RNase，避免RNA降解。實驗過程中盡量戴兩付PE手套，接觸操作臺以外物品后更換外層PE手套。

冰上預冷PBS（用DEPC處理過的水配制，器皿、移液器槍頭、離心管等無DNase及RNase）；

a) 貼壁細胞：倒去培養液后，加入適量預冷PBS漂洗一次（避免大力吹洗損失細胞），按每10cm2（35mm直徑平皿）培養面積加1mL TRIzol的比例加入TRIzol，反復吹打5-10次，使所有細胞充分消化至溶液澄清程度均一，轉移到離心管或凍存管中；

b) 懸浮細胞：離心收集細胞，棄培養液，用預冷PBS漂洗一次，按每5×106細胞加1mL TRIzol的比例加入TRIzol，反復吹打使所有細胞充分消化，轉移到離心管或凍存管中；

液氮速凍后用封口膜封口。

(2) 運輸方式：干冰運輸。

1.2.3 微生物：（注：不同類型的細胞產量差別較大，具體送樣量以達到質檢要求為準。）

(1) 建議選取處于對數生長期的菌液，高速離心收集菌體后，棄上清后菌體于液氮速凍后用封口膜封口。

(2) 運輸方式：干冰運輸。

1.2.4 血液：>4ml （注：根據研究需要選擇相應的方法）

(1) 用EDTA抗凝管采集新鮮血液混勻，建議在2小時候內分離白細胞、PMBC細胞等細胞類型，可直接離心去上清冷凍保存，或者加入TRIzol反復吹打使所有細胞充分消化，轉移到離心管或凍存管中；

液氮速凍后用封口膜封口；

(2) 用EDTA抗凝管采集新鮮血液混勻，可使用QIAamp RNA Blood Mini Kit等抽提RNA，使用方法參考產品說明書；

(3) 如不能及時處理樣品，可使用RNAprotect Animal Blood Tubes收集樣品，用RNeasy Protect Animal Blood Kit等抽提RNA，使用方法參考產品說明書；

(4) 運輸方式：干冰運輸。

注：推薦客戶分裝備份所有寄送樣品，以便用于樣品檢測不合格時分析原因。

1.3. Exosomes相關樣品的處理（銳博提供相關提取服務）

注意：分離exosomes前的樣品不能加入TRIzol、RNAlater等試劑，干冰運輸。

1.3.1 血清樣品

(1) 采血后，輕輕將全血滴入潔凈的EP管或者離心管；

(2) 10min內移至4℃環境靜置3~4小時，可見血塊析出（也可放置4℃冰箱過夜）；

(3) 1000g~2000g，20℃離心10min，可見淡黃色上清；

(4) 取出上清后，10000g，4℃離心10min，以最大程度保證血清質量。

(5) 將血清分裝，送樣前可凍存于-80℃。

提示：送樣量最好2mL以上

1.3.2 血漿樣品（不能用肝素抗凝）

(1) 用采血針和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，輕輕混勻；

(2) 1000g~2000g，20℃離心10min，取上清；

(3) 取出上清后，10000g，4℃離心10min，以最大程度保證血漿質量。

(4) 將血漿分裝，送樣前可凍存于-80℃。

提示：送樣量最好2mL以上

1.3.3 細胞上清

需要提前預備的實驗材料：去除exosomes的血清（自己制備或購買）

(1) 細胞在含正常血清培養基中培養一定時間，當貼壁細胞密度到70%~80%，懸浮細胞密度到60%~70%時；

(2) 對于貼壁細胞，去除培養基，并用PBS清洗1~3遍；對于懸浮細胞，450g~500g水平轉子（700g角轉子），4℃離心10 min收集細胞；

(3) 加入新的不含外泌體的培養基或使用無血清的培養基繼續培養 48h~72h ，根據細胞生長速率收集細胞上清；

(4) 步驟3獲得的上清，450g~500g水平轉子（或300g~700g角轉子），4℃離心10 min去除殘留細胞，收集細胞上清；

(5) 步驟4獲得的上清，10000 g，4℃離心10min，徹底去除細胞碎片，取細胞上清（注意避免吸入細胞或細胞碎片）即可。

提示：送樣量最好20mL以上

1.3.4 尿液

需要提前預備的實驗材料：濾頭

(1) 用15mL離心管收集尿液，最好是收集中段尿液；

(2) 尿液建議繼續用0.22μm的濾頭過濾除菌，收集濾液；

(3) 3000g，4℃離心10min，取上清（注意避免吸入沉淀碎片）即可；

(4) 送樣前可凍存于-80℃。

提示：送樣量最好40mL以上

注：可使用其它規范的分離方法，需注意差速離心的離心條件以便有效去除細胞及細胞碎片。血清，血漿，exosomes等樣品屬于特殊樣品，提取存在風險，銳博生物不承諾提取的成功率。其他特殊樣品請與銷售或技術支持聯系。

表1和表2分別是DNA組織送樣量與RNA組織送樣量

表1. DNA組織送樣量