抗血管生成治療是非小細胞肺癌（NSCLC）的一種十分有前景的治療策略，但由于具有高風險的不良反應，其在肺鱗狀細胞癌（SQC）中的應用受到限制。越來越多的證據表明，長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）通過參與調控NSCLC中的VEGF來介導腫瘤的進展，這可能會指導新的抗血管生成策略的開發。
2020年5月30日，江門市中心醫院（中山大學附屬江門醫院）黃炎明、張鑫等在Molecular Cancer期刊發表了題為LINC00173.v1 promotes angiogenesis and progression of lung squamous cell carcinoma by sponging miR-511-5p to regulate VEGFA expression的研究論文，闡明了LINC00173促進血管內皮細胞增殖、遷移和SQC腫瘤發生的潛在機制，證明LINC00173靶向藥物聯合順鉑可能是治療SQC的合理方案。
研究流程：
1、鑒定肺鱗癌中特異性過表達的lncRNA：生信分析（表達譜數據、TCGA數據）、RT-PCR等
2、過表達lncRNA臨床相關性研究：ISH、Kaplan-Meier生存分析等
3、LncRNA體內外功能研究：shRNA、基因集富集分析（GSEA）、雞胚絨毛尿囊膜（CAM）實驗、H&E染色、RT-PCR和ELISA等
4、LncRNA作為ceRNA促進肺鱗癌血管生成和進展的機制研究：核質分離、TCGA數據集分析、miRanda algorithms、RT-PCR、RIP、熒光素酶報告基因實驗、agomir、antagomir等
5、LINC00173.v1抑制對體內SQC的治療效果研究：ASO等
6、確定LINC00173.v1在SQC中過表達的驅動因子：TCGA數據集分析、免疫組化、ChIP實驗、熒光素酶報告基因實驗、UCSC生物信息學分析、JASPAR2018 algorithms等
以上生信分析/數據庫挖掘（表達譜數據、TCGA數據、Kaplan-Meier生存分析、基因集富集分析等）、熒光素酶報告基因實驗、shRNA、agomir、antagomir、ASO、核質分離、RT-PCR等涉及的產品或服務銳博生物均可提供，歡迎咨詢訂購！
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1、LINC00173.v1在肺鱗癌中特異性過表達
為了鑒定肺鱗癌特異性相關lncRNAs，研究人員首先分析了先前基于AE-meta的肺癌表達譜數據和TCGA數據集，發現LINC00173在SQC中特異性過表達。并通過UCSC genome browser鑒定出兩個具有完全不同外顯子序列的LINC00173轉錄本（LINC00173.v1和LINC00173.v2），其在SQC中的表達均顯著上調。
隨后，研究人員基于LINC00173.v1和LINC00173.v2在TCGA肺癌數據集中的reads進一步分析它們的RSEM百分比，以確定LINC00173在肺癌中的主要亞型，結果發現LINC00173.v1的RSEM百分比要高于LINC00173.v2。此外，RT-PCR分析顯示LINC00173.v1在肺癌組織和細胞系中的ΔCt參考值低于LINC00173.v2。表明LINC00173.v1主要在肺癌組織中表達，并在SQC組織中特異性上調。
2、LINC00173.v1過表達與SQC的復發和轉移有關
為進一步研究LINC00173.v1在肺癌中的臨床意義，研究人員使用ISH檢測了多種肺癌亞型中LINC00173.v1的表達水平。發現LINC00173.v1主要在細胞質中表達，且在SQC組織中強烈上調，值得注意的是在62.5% SQC組織中都觀察到高表達的LINC00173.v1。Kaplan-Meier生存分析顯示LINC00173.v1高表達的SQC患者的無進展生存期（PFS）、總生存期（OS）、無局部復發生存率（LRFS）和無遠處轉移生存率（DMFS）較差。表明LINC00173.v1過表達有助于SQC患者早期復發和轉移。
3、沉默LINC00173.v1抑制血管內皮細胞的增殖和遷移
為了進一步研究LINC00173.v1的生物學功能，研究人員首先通過敲低肺癌細胞中的LINC00173.v1證實其并不影響體外肺癌細胞的增殖和遷移能力。然后，基于TCGA中的LINC00173.v1表達數據進行基因集富集分析（GSEA），發現LINC00173.v1表達水平與血管內皮細胞增殖和遷移相關（血管生成相關）的基因呈密切正相關。
接下來，研究人員試圖探索LINC00173.v1對肺癌細胞中血管內皮細胞增殖和遷移的影響。發現LINC00173過表達不僅促進了人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)網狀結構的形成，而且增強了HUVECs的遷移能力；沉默LINC00173.v1則產生相反的結果。雞胚絨毛尿囊膜（CAM）實驗顯示過表達/沉默LINC00173.v1可增加/縮短CAM培養的肺癌細胞第2和3血管長度，進一步證實了LINC00173.v1的血管生成作用。此外，RT-PCR和ELISA分析顯示血管內皮細胞增殖和遷移相關基因VEGF-A與LINC00173表達的變化明顯相關。表明沉默LINC00173.v1通過影響VEGFA的表達來抑制血管內皮細胞的增殖和遷移。
4、沉默LINC00173.v1抑制肺癌細胞的腫瘤發生
為了確定LINC00173.v1對體內腫瘤發生的作用，研究人員將LINC00173.v1沉默的肺癌細胞注射到小鼠體內，發現腫瘤的重量和體積減少、腫瘤壞死面積增加、淋巴或血管密度降低(CD31+ LBV)；而上調LINC00173.v1則產生相反的效果。
接下來，研究人員進一步研究了LINC00173.v1對肺部肺癌細胞致瘤能力的影響。發現沉默LINC00173.v1可以顯著抑制NCI-H520細胞在肺中的生長，表現為癌細胞數量減少、腫瘤壞死面積增加和累積生存期延長。而上調LINC00173.v1可以增加癌細胞的數量、減少小鼠的腫瘤壞死面積和累積生存期。表明沉默LINC00173.v1可以在體內抑制肺癌細胞的腫瘤發生。
5、LINC00173.v1充當miR-511-5p的競爭性內源RNA
核質分離和ISH實驗顯示LINC00173.v1主要在細胞質中表達，表明LINC00173.v1可能以ceRNA的方式在肺癌中發揮其功能。因此，研究人員通過TCGA肺癌數據集和RT-qPCR分析發現有6個miRNAs表達水平與LINC00173.v1負相關，并且在SQC組織中下調，但其中僅有miR-511-5p的表達水平可被野生型LINC00173.v1的表達變化顯著影響。使用miRanda algorithms進一步支持了只有miR-511-5p在LINC00173.v1上具有潛在識別序列。
接著，研究人員通過RIP證實miR-511-5p在LINC00173.v1轉錄本直接相關。熒光素酶檢測發現上調/沉默miR-511-5p可抑制/增強LINC00173.v1的熒光素酶報告基因活性，而不是突變體LINC00173.v1。重要的是agomir-511-5p（由銳博生物提供）可消除LINC00173.v1過表達誘導的血管內皮細胞增殖和遷移，而antagomir-511-5p（由銳博生物提供）可逆轉LINC00173.v1下調對血管內皮細胞增殖和遷移的抑制作用。表明LINC00173.v1通過充當miR-511-5p的ceRNA來促進血管內皮細胞的增殖和遷移。
6、miR-511-5p/VEGFA軸對于LINC00173.v1誘導體內腫瘤發生至關重要
通過miRanda algorithms分析、RT-qPCR、RIP實驗、熒光素酶報告基因試驗，研究人員確定了VEGFA是miR-511-5p的真實靶點。為了進一步探索miR-511-5p/VEGFA軸在LINC00173.v1的促腫瘤作用中的功能意義，研究人員將貝伐單抗（一種重組VEGF單克隆抗體）首次用于小鼠異種移植模型。結果發現貝伐單抗顯著抑制了LINC00173.v1過表達肺癌細胞形成的腫瘤重量和體積的生長。由于miR-511-5p直接靶向VEGFA，因此如預期的那樣，agomir-511-5p有效抑制了LINC00173.v1過表達肺癌細胞的致瘤能力，甚至達到了與貝伐單抗治療相當的水平。另一方面，突變的LINC00173.v1過表達肺癌細胞形成的小鼠腫瘤要比野生型形成的更小、更輕。此外，用貝伐單抗、agomir-511-5p（由銳博生物提供）處理以及接種LINC00173.v1過表達肺癌細胞的小鼠腫瘤組織中的CD31+ LBV密度差異性下調。表明LINC00173.v1通過miR-511-5p/VEGFA信號軸促進肺癌細胞的腫瘤發生。
7、LINC00173.v1抑制對體內SQC的治療作用
為了研究內源性LINC00173.v1在體內SQC細胞腫瘤發生中的病理生理功能，研究人員使用靶向LINC00173.v1的ASO注射到小鼠體內。發現肺腫瘤生長被抑制，表現為癌細胞數量減少和累積生存期延長。在肺癌的臨床治療中，抗血管生成治療一般與化療藥物如順鉑聯合使用，因此，研究人員進一步評估LINC00173.v1 ASO與順鉑的治療效果。結果發現，向順鉑治療小鼠注射LINC00173.v1 ASO可以極大地促進順鉑對肺癌細胞所致腫瘤病灶的治療效果，甚至與貝伐單抗和順鉑聯合的治療效果相當，這表明LINC00173.v1抑制可能是治療SQC有效的治療策略。
8、ΔNp63α有助于LINC00173.v1在SQC中過表達
對TCGA肺癌數據集的分析顯示，隨著鱗狀細胞癌特異性因子ΔNp63α的表達水平從低、中到高增加，SQC組織中LINC00173.v1表達水平逐漸升高，表明ΔNp63α可能是SQC組織中LINC00173.v1特異性過表達的原因。因此，研究人員首先通過免疫組化發現ΔNp63α定位于細胞核，且在SQC組織中高表達。重要的是，在LINC00173.v1高水平的SQC組織中，ΔNp63α表達陽性染色的百分比為100％。RT-PCR進一步證實了上調ΔNp63可增加LINC00173.v1的表達。
接下來，研究人員通過UCSC生物信息學分析和JASPAR2018 algorithms，在LINC00173.v1的假定啟動子區域中發現了5個ΔNp63α結合motifs。ChIP分析顯示ΔNp63α對肺癌細胞LINC00173.v1啟動子區域中的P2和P4結合位點具有高親和力。熒光素酶報告基因實驗顯示ΔNp63α過表達肺癌細胞中LINC00173.v1啟動子的熒光素酶活性增強，但是LINC00173.v1啟動子的熒光素酶活性會因P2或P4的突變而降低，但當P2和P4的結合位點均發生突變時，不會受到ΔNp63α的明顯影響。表明ΔNp63α通過調節轉錄有助于SQC組織中的LINC00173.v1過表達。
綜上所述，這些發現支持這樣的觀點，即鱗狀細胞癌特異性因子ΔNp63α有助于SQC組織中LINC00173.v1的過表達，LINC00173.v1通過充當miR-511-5p海綿調節VEGFA表達從而進一步促進血管內皮細胞的增殖和遷移以及肺鱗狀細胞癌的發展。
