N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳動物細胞中最普遍的mRNA修飾。然而，m6A在特定致癌長鏈非編碼RNAs（ncRNAs）上的疾病相關功能尚不清楚。為此，天津醫科大學第二醫院牛遠杰課題組在Molecular Cancer期刊上發表了題為Long non-coding RNA NEAT1 promotes bone metastasis of prostate cancer through N6-methyladenosine的研究論文。揭示了ncRNA NEAT1-1上的m6A在調節Pol II ser2磷酸化中起關鍵作用，預示其可能是骨轉移癌治療和診斷的新特異性靶點。并且新復合物CYCLINL1/CDK19/ NEAT1-1可能為骨轉移性前列腺癌發病和發展的潛在機制提供新的見解。
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本研究主要實驗結果：
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? ?NEAT1-1 m6A水平在前列腺癌中升高并且是患者的不良預后因素
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NEAT1-1作為一種致癌ncRNA在多種癌癥中高表達。為了研究NEAT1-1 m6A修飾在臨床病理相關背景下的作用，研究人員從鄰近正常癌、原發癌、淋巴結轉移癌和骨轉移癌新鮮樣本中獲取m6A抗體免疫沉淀的RNA。箱線圖分析顯示骨轉移性前列腺癌樣本中NEAT1-1 m6A水平顯著高于原發性前列腺癌或癌旁正常樣本。Kaplan-Meier生存分析顯示高水平的NEAT1–1或NEAT1–1 m6A與前列腺癌骨轉移患者的生存期和原發性前列腺癌患者的總生存期較短有關。
? ?在前列腺癌的NEAT1-1中鑒定出四個m6A位點
m6A位點通常位于mRNA的3’UTR。為了在NEAT1-1上確定真正的m6A位點，研究人員通過m6A RIP-seq數據分析發現在NEAT1變體1（NEAT1-1）上有4個高峰值，而在NEAT1變體2（NEAT1-2）的其他區域有低信號。因此，研究人員重點關注了NEAT1-1的m6A，并按照NEAT1-1的5’-3’依次將m6A位點標記為#1到#4。CLIP-PCR分析發現在前列腺癌P-18細胞中，所有四個位點的m6A信號均顯著高于相鄰位點。
? ?NEAT1-1通過m6A位點#4與CYCLINL1相互作用
為了發現NEAT1-1上m6A的分子功能，研究人員生成了NEAT1-1-1野生型（WT）和m6A缺失突變質粒。質譜分析顯示NEAT1-1 WT（而不是m6A突變型）結合多種蛋白，包括CYCLINL1。有趣的是，通過GO和KEGG分析發現了多種與轉移相關的途徑，包括與細胞外泌體、髓鞘和核纖層蛋白絲相關的途徑。pull down和western blot實驗也證實了只有CYCLINL1與NEAT1-1結合。
為了確定m6A在與CYCLINL1相互作用中的作用，研究人員敲低了P-18細胞中的m6A writer METTL3。CLIP分析發現在P-18細胞中CYCLINL1與NEAT1-1相關，但在METTL3敲除的P-18細胞中則與NEAT1-1不相關。進一步的RNA pull-down實驗顯示只有#4 m6A位點突變阻止了與CYCLINL1的結合。此外，#4 m6A位點介導了NEAT1-1與CYCLINL1的相互作用。表明NEAT1-1在前列腺PDX原代細胞中是通過其#4 m6A位點與CYCLINL1相互作用。
? ?NEAT1-1是連接CYCLINL1和CDK19的“橋梁”
質譜分析顯示NEAT1-1與CYCLINL1和CDK19相互結合。為了證明CYCLINL1或CDK19與NEAT1-1之間的直接或間接結合，研究人員通過RBRDetector搜索了CYCLINL1和CDK19中潛在的RNA結合殘基(RBR)。發現CDK19中有一個GxxGxG結構域，CYCLINL1中有四個富含精氨酸的結構域，都是潛在的RNA識別基序(RRMs)。進一步的研究發現GxxGxG結構域的缺失阻斷了CDK19和NEAT1-1的相互作用，并且CYCLINL1 C末端兩個富含精氨酸的結構域是其與NEAT1-1相互作用所必需的。
為了進一步確定細胞內的NEAT1-1結合區域，研究人員通過iCLIP進行了相互作用分析。結果發現NEAT1-1在1-600nt內與CDK19結合；NEAT1-1在3100-3756 nt內與CYCLINL1結合。RNA EMSA顯示CDK19與NEAT1-1 1-600 nt中獨特的U-rich結構域（487-493 nt）相關，CYCLINL1與NEAT1-1 3100-3756 nt內的m6A結構域相關。Co-IP實驗表明，RNA的破壞抑制了CYCLINL1和CDK19之間的相互作用。表明NEAT1-1是連接CYCLINL1和CDK19的橋梁。
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? ?NEAT1-1在體外和前列腺癌中通過m6A激活pol II Ser2磷酸化
CDK19可調節RNA聚合酶II（RNPII）介導基因表達。本研究發現CDK19可在P-18中被NEAT1-1下拉。為了檢測CDK19、NEAT1-1和CYCLINL1復合物的活性，研究人員通過體外RNPII磷酸化實驗發現加入NEAT1-1可激活Ser2中的RNPII磷酸化，并且通過siRNAs和ASOs敲低P-18中的NEAT1-1阻止了Ser2中的RNPII磷酸化，但沒有阻止Ser5。此外，NEAT1–1的缺失會導致RNPII Ser2磷酸化的下調，NEAT1-1 WT可增加RNPII ser2磷酸化，但是#4突變則沒有。表明NEAT1-1通過#4 m6A位點激活了RNPII Ser-2磷酸化。
? ?NEAT1-1通過m6A位點＃4在RUNX2啟動子上募集CYCLINL1和CDK19
為了尋找CYCLINL1/CDK19/NEAT1-1復合物的靶基因，研究人員通過RNA-seq發現了5166個可以通過刪除NEAT1-1和刪除NEAT1-1位點#4 m6A來調節的靶基因。其中部分靶基因為骨轉移相關基因，如RUNX2。接下來，研究人員通過DNATriplex預測發現NEAT1-1可能與RUNX2的啟動子相互作用。ChIRP 實驗證實了NEAT1-1與RUNX2的啟動子在?200nt~?50nt區域相互作用。
為了探索NEAT1-1是否將CYCLINL1或CDK19募集到RUNX2的啟動子上，研究人員通過ChIP實驗檢測了CYCLINL1的結合。結果顯示通過CRISPR系統將NEAT1-1刪除和NEAT1-1 ＃4 m6A-mut挽救后，阻斷了CYCLINL1與RUNX2啟動子的結合。此外，過表達NEAT1-1 WT增加了RUNX2 RNA和蛋白水平，而NEAT1-1 m6A #4突變未能上調RUNX2 RNA和蛋白水平。表明#4 m6A位點通過RNA-DNA相互作用促使NEAT1–1將CYCLINL1和CDK9募集到RUNX2啟動子上。
? ?NEAT1-1通過m6A促進前列腺PDX生長
為了研究NEAT1-1 m6A在體內的功能，研究人員使用異種移植模型來確定NEAT1-1的m6A調節對前列腺PDXs生長和轉移的影響程度。結果顯示過表達NEAT1-1 WT降低了小鼠的生存期，也增加了對骨盆骨和/或肺部轉移的可能性。此外，NEAT1-1 WT能促進P-18和P-34 PDXs的側翼腫瘤生長，而不是NEAT1–1 #4 m6A突變體。在NEAT1-1 WT過表達的側腹腫瘤中，RUNX2 RNA和蛋白水平均明顯更高。表明NEAT1-1 WT上調了RNPII Ser2的磷酸化水平以及RUNX2 RNA和蛋白水平，但m6A突變組則不能。由此可見，NEAT1-1 m6A可在小鼠PDX模型中促進腫瘤的生長和轉移。
總之，本研究在ncRNA中發現了新的m6A功能，其在骨轉移性前列腺癌中發揮致癌作用，并且與不良預后相關。進一步的實驗表明，NEAT1-1 m6A促進了新復合物CYCLINL1/CDK19對Pol II Ser2磷酸化的致癌作用。研究結果表明，ncRNA m6A在調節前列腺癌的進展中起著至關重要的作用，并且可能是癌癥治療和診斷的新靶標。涉及新復合物CYCLINL1/CDK19/NEAT1-1的調控網絡可能會為骨轉移性前列腺癌的發病機制和發展的潛在機制提供新的見解。
原文鏈接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-01293-4#Sec35
