乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一。盡管在診斷和聯合治療方面取得了進展，但乳腺癌患者的預后仍然不令人滿意。轉移是癌癥相關死亡的主要原因之一，這極大地阻礙了治療的成功。因此，更全面地了解乳腺癌的進展和轉移機制，對于改善乳腺癌患者的預后具有重要意義。
近年來，研究人員發現長鏈非編碼RNAs參與了各種生理和病理過程，特別是在癌癥中。LncRNAs是具有200多個核苷酸的轉錄本，沒有蛋白質編碼潛能。已被證實lncRNAs在癌癥中經常失調，并參與多種惡性腫瘤的進展和轉移。LncRNA ANCR被發現可介導EZH2的降解，從而減弱乳腺癌的轉移能力。此外，發現lncRNA AGAP2-AS1在乳腺癌中被上調，并與曲妥珠單抗耐藥有關。然而，絕大多數lncRNAs在乳腺癌調控中的臨床意義和生物學機制仍然未知。
多項研究表明，LncRNAs可能作為ceRNAs發揮調節microRNAs生物學功能或表達的作用。例如，lncRNA LINC00963通過在乳腺癌細胞中充當miR-324-3p的ceRNA來促進腫瘤發生和抗輻射性。LncRNA NONHSAT101069通過有效充當miR-129-5p的ceRNA，從而調節Twist1的抑制作用，促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲，以及對表柔比星的耐藥性。之前的研究表明，缺氧是腫瘤微環境的主要標志之一，與許多實體腫瘤的進展和轉移有關。HIF-1α是一個廣泛研究的缺氧誘導因子（HIF），通過下游靶基因的反式激活介導細胞對缺氧的反應。在常氧條件下，HIF-1α受到蛋白酶體降解，而低氧條件下則保護HIF-1α不被降解，從而使HIF-1α易位到細胞核中以啟動基因表達。近年來，低氧條件在調節lncRNAs表達中的作用已受到廣泛關注，并且各種缺氧反應性lncRNAs在腫瘤發生和腫瘤進展中起重要作用。然而，在缺氧介導異常lncRNA表達的機制以及lncRNA在乳腺癌中的功能方面還有待進一步研究。
為了解決以上科學問題，山東大學齊魯醫院楊其峰教授課題組近日在Molecular Cancer（IF10.679）期刊上發表了題為LncRNA BCRT1 promotes breast cancer progression by targeting miR-1303/PTBP3 axis的研究論文。揭示了LncRNA BCRT1通過靶向miR-1303/PTBP3軸促進乳腺癌進展的作用機制，為乳腺癌的轉移機制提供了新的見解。暗示lncRNA BCRT1可能是乳腺癌的潛在生物標志物和治療靶標。
文章的大致研究思路是這樣的：
以上實驗方法涉及的相關產品或服務銳博生物均可以提供！
首先，研究者使用GSE112848和TCGA公共數據庫分析lncRNA表達譜以鑒定可能參與乳腺癌進展的重要lncRNAs，并且主要關注上調的lncRNAs，因為這些lncRNAs可能作為治療靶點或預后生物標志物。結果發現lncRNA BCRT1是乳腺癌組織中顯著上調的lncRNAs之一，沒有蛋白編碼潛能。RT-PCR進一步驗證發現lncRNA BCRT1在乳腺癌組織中明顯過表達。此外，高表達lncRNA BCRT1與較短的無病生存期(DFS)和總生存期(OS)顯著相關。核質分離實驗和FISH實驗顯示lncRNA BCRT1主要位于細胞質。
體內外功能實驗發現敲低lncRNA BCRT1可顯著降低乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力；而過表達lncRNA BCRT1則顯著增加乳腺癌細胞的增殖和克隆形成，并顯著增加體內腫瘤的大小和體積，以及肺轉移病灶的體積和數量。表明lncRNA BCRT1對于促進乳腺癌的增殖和腫瘤轉移具有重要作用。
由于lncRNA BCRT1主要分布在細胞胞質中，研究者推測lncRNA BCRT1可能充當miRNA海綿，阻止miRNA與其靶mRNA結合，并通過RegRNA數據庫預測、熒光素酶報告基因分析、RIP實驗證實了miR-1303是lncRNA BCRT1的潛在靶點。
接著，研究者探索了miR-1303在乳腺癌中的作用。發現轉染miR-1303 mimics可降低乳腺癌細胞的增值、遷移和侵襲，增加細胞凋亡。重要的是，拯救實驗進一步驗證了lncRNA BCRT1與miR-1303之間的功能關系。
隨后，通過miRDB、miRWalk、miRPathDB和TargetScan數據庫，研究者發現PTBP3是miR-1303的潛在靶標，并且使用TCGA和GEO數據庫發現PTBP3在乳腺癌組織中的表達升高，而高表達PTBP3與乳腺癌患者預后不良相關。此外，PTBP3在乳腺癌細胞中的表達與lncRNA BCRT1的表達呈正相關，過表達miR-1303或敲低lncRNA BCRT1可降低PTBP3 mRNA和蛋白水平。挽救實驗中，過表達miR-1303可以部分抵消lncRNA BCRT1過表達引起的乳腺癌細胞中PTBP3表達的增加。進一步的熒光素酶報告基因實驗證實了PTBP3是miR-1303的直接靶點。
為了確定PTBP3在乳腺癌中的作用，研究者敲低PTBP3發現乳腺癌細胞增殖顯著被抑制，細胞凋亡增加，此外乳腺癌細胞的遷移和侵襲減弱。表明PTBP3在乳腺癌中起著腫瘤啟動子的作用，并且lncRNA BCRT1通過調節miR-1303對PTBP3的表達起到了重要的調控作用。
為了確定lncRNA BCRT1是否有助于M2極化，研究者檢測了lncRNA BCRT1在非極化巨噬細胞、M1巨噬細胞和M2巨噬細胞中的表達。發現lncRNA BCRT1在M2巨噬細胞中表達升高，暗示了lncRNA BCRT1在巨噬細胞極化中的潛在作用。另外，敲低lncRNA BCRT1可導致M2標記物顯著降低；而過表達lncRNA BCRT1則得到相反的結果，并且lncRNA BCRT1過表達乳腺癌細胞的上清液也會導致M2標記物的表達升高。
然后，研究者試圖探究乳腺癌細胞和巨噬細胞之間的通訊調節機制。由于許多研究報道了lncRNAs可以通過外泌體轉移調節腫瘤微環境。因此研究者從乳腺癌細胞培養上清中提取外泌體，以確定lncRNA BCRT1是否能被外泌體包裹。結果發現在乳腺癌細胞中LncRNA BCRT1過表達會導致分泌的外泌體中LncRNA BCRT1水平升高，而LncRNA BCRT1敲低則產生相反的結果，說明外泌體中存在lncRNA BCRT1。隨后，對乳腺癌細胞來源的外泌體進行標記，并與巨噬細胞一起培養，證實了標記的外泌體RNAs可被巨噬細胞吸收。接著，將lncRNA BCRT1過表達細胞分離的外泌體與未極化的巨噬細胞共培養，發現lncRNA BCRT1和M2表型標志物表達顯著升高，暗示外泌體lncRNA BCRT1促進了M2極化。此外，lncRNA BCRT1過表達細胞分離的外泌體或上清液處理巨噬細胞顯著促進了細胞遷移和血管生成。以上結果表明lncRNA BCRT1可以通過外泌體轉移，從而促進M2表型極化并增強其腫瘤促進功能。
接下來，為了研究lncRNA BCRT1是否為缺氧敏感的lncRNA，研究者對乳腺癌細胞進行了缺氧或常氧處理。結果發現隨著HIF-1α表達的增加，lncRNA BCRT1的表達明顯升高。而敲低HIF-1α極大地減弱了缺氧誘導的lncRNA BCRT1上調。為了闡明缺氧誘導lncRNA BCRT1上調的潛在機制，研究者分析了JASPAR數據庫，在lncRNA BCRT1啟動子中鑒定出兩個假定的HIF-1α反應元件（HRE），并通過熒光素酶報告基因實驗證實了HRE1對lncRNA BCRT1的轉錄至關重要。ChIP實驗進一步證實了HIF-1α與lncRNA BCRT1啟動子中的兩個預測HRE結合，并且lncRNA BCRT1啟動子中的HRE1是介導HIF-1α誘導的轉錄調控的主要區域。以上結果表明缺氧是通過HIF-1α與lncRNA BCRT1啟動子上的HRE1直接結合從而轉錄調控lncRNA BCRT1的表達。
缺氧是腫瘤微環境的一個標志，與各種實體腫瘤的增殖、轉移和耐藥有關。因此，研究者需要確定lncRNA BCRT1是否參與了缺氧誘導的細胞增殖。結果發現缺氧處理導致lncRNA BCRT1和PTBP3表達增加，與細胞增殖增強一致。敲低HIF-1α或lncRNA BCRT1減弱了缺氧誘導的作用，而過表達lncRNA BCRT1部分逆轉了HIF-1α敲低的抑制作用。此外，缺氧處理后，乳腺癌細胞表現出更多成纖維細胞樣形態并且遷移能力增強，而敲低HIF-1α或lncRNA BCRT1可顯著逆轉這一狀態。另外，lncRNA BCRT1過表達明顯挽救了低氧條件下siHIF-1α抑制的EMT圖譜。以上結果表明，lncRNA BCRT1可能參與了缺氧誘導的乳腺癌細胞的生物學功能。
總的來說，研究結果揭示了用于乳腺癌進展的新的HIF-1α/ lncRNA BCRT1 / miR-1303 / PTBP3途徑，并表明lncRNA BCRT1可能是乳腺癌的潛在生物標志物和治療靶標。
*本研究細胞增殖實驗所使用的EdU產品由銳博生物提供！
