一胖毀所有！母親肥胖可增加后代患肝癌幾率，竟是因為這個miRNA

三分之一的人口超重或肥胖。流行病學研究表明，肥胖是結腸癌、乳腺癌和肝癌等惡性腫瘤的獨立危險因素。例如，肥胖使罹患肝癌的幾率增加了1.5-4.0倍。一項針對90萬美國人進行的16年前瞻性研究發現，肥胖男性和女性的肝癌發病率分別比非肥胖人群高4.52倍和1.68倍。

在美國，新近診斷出的HCC中有高達50％是由非酒精性脂肪肝疾?。∟AFLD）等肝代謝異常所引起的。母親肥胖在肥胖流行和代謝性疾病中起著至關重要的作用，直接影響后代的健康。肥胖母親的后代罹患代謝性疾?。ò∟AFLD）的風險增加，與父親的體重無關，這表明母親因素在肥胖遺傳中起主要作用。之前的研究表明，多代暴露于高脂飲食（HFD）壓力的母親的后代表現出肥胖和NAFLD評分的逐漸增加。然而，目前尚不清楚肥胖母親的后代是否更容易發展為HCC等惡性腫瘤。

多代肥胖涉及表觀遺傳機制。越來越多的證據表明，非編碼RNAs會在其后代中介導可遺傳的表型，例如母體循環microRNAs（miRNAs）已被認為可以穿過胎盤并影響后代的表型。然而，尚未確定母親非編碼RNAs與后代疾病發展之間的聯系。

2020年6月25日，武漢大學生命科學學院鄭凌教授和華中科技大學同濟醫學院附屬同濟藥學院黃昆教授在Journal of Hepatology（最新IF20.5852）期刊上發表了題為Multigenerational maternal obesity increases the incidence of HCC in offspring via miR-27a-3p的科研成果。報道了一個在肥胖母親中上調的microRNA（miR-27a-3p），其可以傳遞給后代。這種microRNA通過調控2個基因（Acsl1和Aldh2）來增加后代患肝癌的風險。該機制可能成為未來的治療靶點。

實驗設計

為了研究多代HDF應激母親的后代的HCC易感性，實驗設計如下：

1. 雌性小鼠（F0代）從1個月至3個月大時接受正常食物（NC）或HFD（60％千卡脂肪）喂養，并與NC喂養的雄性小鼠交配以繁殖如先前報道的F1代。

2. F2代的產生與此類似。

3. F0、F1和F2代雄性小鼠在p15時通過腹腔注射25mg/kg的DEN（二乙基亞硝胺），并在斷奶后維持HFD，分別命名為HFD1D、HFD2D和HFD3D組。

4. 同時，將相同年齡注射PBS（NC組）或DEN（NCD組）的F0代雄性小鼠（維持正常飲食）作為對照組。

5. 各組均在40周齡時被處死。HCC的發生率是通過解剖顯微鏡下腫瘤計數來確定的（直徑2-8 mm的腫瘤稱為“腫瘤”；直徑> 8 mm的腫瘤稱為“大腫瘤”）。收集血清、腫瘤（直徑> 2 mm）和非腫瘤組織用于進一步分析。

研究結果

1、 母體多代HFD暴露會增加后代的HCC發生率

研究發現與HFD1D和NCD組相比，HFD2D和HFD3D組的存活率顯著降低，且這兩組之間是無差異的。與NCD和NC小鼠相比，HFD1D和HFD2D組的血清TC和TG水平顯著升高，而HF3D組則進一步明顯升高，表明世代HFD應激逐漸增加了后代的脂毒性。值得注意的是，在HFD喂養+DEN應激下，后代的腫瘤數量和大小一代代逐漸增加。H&E和三色染色實驗也證實了HFD喂養+DEN應激導致后代的肝臟病理一代代逐漸惡化。

2、 母體多代HFD暴露會增加后代（經受HFD+DEN處理）的肝臟炎癥和細胞增殖

免疫細胞浸潤和肝細胞增殖增加是肝癌發展的重要特征。在HFD+DEN應激下，研究人員在未來幾代后代的肝臟中發現F4/80（巨噬細胞標志物）、CD3（T細胞標志物）、Ly-6G（嗜中性粒細胞標志物）和Ki67（細胞增殖標志物）染色的肝細胞數量逐漸增加。肝損傷標志物（如血清AST和ALT）在后代中也逐漸增加。與NC小鼠相比，NCD、HFD1D和HFD2D組的血清AFP（一種HCC診斷標志物）水平升高，而在HFD3D小鼠中則進一步升高。此外，與NC小鼠相比，NCD小鼠的血清炎癥標志物IL-6和TNFa28的水平升高，而HFD2D和HFD3D組則進一步升高。

3、 代謝相關基因隨著世代而變化

為了探索多代母體HFD暴露是如何增加后代的HCC發生率，研究人員對腫瘤進行了RNA測序。發現不同組間基因顯著改變相關的前10個KEGG通路中，大多數與代謝有關。對代謝途徑中富集的基因進行進一步分析，發現這些基因大部分下調，屬于脂質和/或氨基酸代謝。qPCR證實了在HFD+DEN應激下，未來幾代后代肝臟中的Aldh2、Acsl1、Apoa5、Apol7a、Rbp4、Akr1c6、Acaa2、Acaa1b、Glul、Car3、Hamp和Hamp2水平逐漸降低。在這些基因中，研究人員主要關注Acsl1和Aldh2，因為在TCGA分析中，它們的水平與HCC呈顯著負相關。此外，HCC患者Acsl1或Aldh2水平較低，其總體生存率較差。因此，研究人員接下來需要驗證Acsl1和Aldh2是否與后代HCC發病率增加有關。

4、 敲低Acsl1和Aldh2協同促進HFD后腫瘤生長

體外實驗顯示對Acsl1和Aldh2進行單個敲低或同時敲低均可增加HCC細胞增殖。但與敲低單個基因相比，同時敲低可顯著誘導HCC細胞增殖，表明Acsl1和Aldh2協同影響細胞增殖。為了研究敲除Ascl1或/和Aldh2是否會加劇體內腫瘤的生長，研究人員進行了皮下異種移植。異種移植前，裸鼠接受NC（正常飲食）或HFD喂養8周，HFD喂養小鼠的體重、血清TC和TG水平顯著增加。

NC喂養條件下，與對照組相比，shAcsl1、shAldh2和shAcsl1+shAldh2組的腫瘤生長速度和大小/重量顯著增加，且各組間無顯著差異。而在HFD喂養條件下，與對照組相比，shAcsl1或shAldh2組的腫瘤生長速度和大小/重量也有所增加，但是shAcsl1 + shAldh2組的腫瘤生長速度和大小/重量進一步增加。值得注意的是，與相應的NC喂養組相比，HFD喂養組的腫瘤生長速度、大小和體重均顯著增加。

5、 肝臟miRNAs隨著世代而變化

研究人員通過RNA測序檢查了后代肝臟中的miRNA水平。發現不同組間miRNAs顯著改變的前10個KEGG通路中，大多數與癌癥發展有關。熱圖顯示了一組隨著世代變化而逐漸改變的miRNAs。qPCR證實在腫瘤中，miR-210-3p、miR-223-3p、miR-222-5p、miR-322-5p、miR-34c-5p、miR-27a-3p、miR-21a-5p、miR- 486a-5p和miR-532-5p在后代中逐漸增加。TCGA分析表明，HCC患者中包括miR-27a-3p在內的5種miRNAs水平較高時，其生存率顯著降低。

生物信息學分析表明miR-27a-3p可能調節Acsl1和Aldh2的轉錄。miR-27a-3p mimic或inhibitor處理可顯著降低或增加Acsl1和Aldh2的mRNA以及蛋白水平。為了評估miR-27a-3p是否調節Acsl1或Aldh2 mRNA的轉錄，研究人員通過熒光素酶報告基因檢測發現共轉染miR-27a-3p mimic與野生型（而不是突變體）Acsl1或Aldh2的3’-UTR，大大降低了它們的轉錄水平，通過螢光素酶活性的降低可以證明。而miR-27a-3p inhibitor的作用相反。

為了進一步研究miR-27a-3p對腫瘤生長的影響，進行了皮下異種移植實驗。HFD喂養8周的裸鼠皮下注射HepG2細胞（第0天），然后將miR-27a-3p agomir注射到腫瘤中（從第6天到第16/18天），每隔一天注射一次。發現在agomir治療的小鼠中，腫瘤的生長速度和大小顯著增加。agomir注射可顯著上調miR-27a-3p以及腫瘤中Acsl1/Aldh2的mRNA和蛋白質水平。注射antagomir則效果相反。這些數據表明，miR-27a-3p調節Acsl1和Aldh2，影響HCC的發展。

6、 HFD喂養的母親血清miR-27a-3p水平升高會影響后代HCC易感性

母體miRNAs被認為會影響胎兒表型。因此，研究人員檢測了母系血清中的9個miRNAs，發現HFD應激的母系血清中的miR-27a-3p水平逐漸升高，推測母體血清miR-27a-3p水平的改變可能會影響后代肝臟miR-27a-3p及其靶基因的水平。為了驗證這種猜想，研究人員將miR-27a-3p agomir注射到懷孕的C57BL/6小鼠體內，從E12.5到E18.5期間，每隔一天注射一次。發現通過提高母體血清中的miR-27a-3p水平，可顯著上調胎兒和幼鼠體內的miR-27a-3p水平和下調Acsl1、Aldh2的mRNA和蛋白水平。

為了驗證母體血清miR-27a-3p水平的改變是否會影響其后代的HCC易感性。研究人員將miR-27a-3p agomir注射到懷孕的C57BL/6小鼠體內，雄性后代在p15時接受DEN處理，斷奶后用NC或HFD喂養。結果發現，無論飲食如何，其后代中發現的腫瘤數量均顯著增加；而HFD條件下后代的腫瘤負擔更重。H&E和三色染色顯示后代的肝臟病變加重，而在HFD喂養的后代中發現了最顯著的變化。此外，后代肝臟miR-27a-3p水平顯著上調，而Acsl1和Aldh2的mRNA和蛋白水平下調。

7、 （非）脂肪肝HCC患者中miR-27a-3p與Acsl1和Aldh2呈負相關

為了研究miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2軸在HCC中的臨床相關性，研究人員獲得了54例臨床樣本（27例脂肪肝相關HCC，27例非脂肪肝相關HCC）。檢測發現Acsl1和Aldh2在腫瘤組織中的水平明顯低于非腫瘤組織，脂肪肝樣本中的Acsl1和Aldh2水平也明顯低于非脂肪肝樣本。同樣地，miR-27a-3p在腫瘤組織中的水平顯著高于非腫瘤組織，而在脂肪肝樣本中的miR-27a-3p水平顯著高于非脂肪肝樣本。相關性分析進一步揭示了miR-27a-3p與Acsl1或Aldh2的表達呈負相關。

總之，該研究通過RNA測序鑒定了后代肝臟中miRNAs和基因的多代變化。并使用數據庫和臨床樣本、腫瘤異種移植、培養細胞和小鼠模型證明了母親肥胖通過miR-27a-3p-Acsl1/Aldh2軸在代與代之間起作用的表觀遺傳機制，該機制在調節肥胖母親后代的HCC發生中具有重要作用。

本研究使用到的miRNA qPCR Starter Kit (C10712)、miRNA PCR Primer Sets、動物用產品(agomir、antagomir)、細胞用產品(mimic、inhibitor)、轉染試劑盒(C10511-1)等均由銳博生物提供。