產品簡介
Bulge-LoopTM ?miRNA qRT-PCR是銳博生物自主研發的miRNA成熟鏈檢測方法，該方法基于特異性的莖環狀RT引物及正反向引物，并采用SYBR Green染料檢測，無需熒光探針，具有高靈敏度和高特異性的優點。Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit包括該檢測方法所需要的RT酶，qPCR酶，客戶僅需配合相應的Bulge-LoopTM miRNA Primer set及內參（如U6，5S）即可進行高效檢測。
| Reagent?(In tube) | C10211-1 (20T RT + 60T qPCR) | C10211-2?(100T RT + 300T qPCR) | C10211-3?(500T RT + 1500T qPCR) |
| RTase Mix | 40 μL | 200 ?μL | 1 ml |
| 5X Reverse Transcription Buffer | 40 μL | 200 μL | 1 ml |
| 2X SYBR Green Mix | 600 μL | 1 ml X 3 | 1 ml X 15 |
運輸保存
產品需低溫運輸。收到產品后，請于-20℃保存，可以穩定保存一年。
使用前請瞬時離心。
實驗方法
miRNA RT反應
1）取Bulge-LoopTM ?miRNA RT Primer (20 μM)，加入適量RNase-free H2O，配置成Bulge-LoopTM ?miRNA RT Primer (5 μM)。
2）推薦以10 μl RT反應體系進行實驗：
| Reagent | 10 μL?體系 | 終濃度 |
| RNA Template (1 μg) | x μL | ? |
| Bulge-LoopTM miRNA RT Primer (5 μM) | 1 μL | 500 nM |
| 5X Reverse Transcription Buffer | 2 μL | 1X |
| RTase Mix | 2 μL | ? |
| RNase-free H2O | 至10 μL | ? |
以上體系混勻后，瞬時離心，RT反應程序為：42℃ 60 min，70℃ 10 min。
注：
1）最佳RT引物濃度依據具體實驗而定，引物濃度范圍可在200nM～800nM之間優化；
2）RT反應結束后請立即將cDNA產物取出，快速置于冰上冷卻；
3）內參引物（U6，5S等）的使用與miRNA的檢測方法一致。
miRNA qPCR反應
1）SYBR Green Mix：包括Taq酶、dNTP mix、PCR Buffer、SYBR GreenⅠ等。
推薦以20 μl qPCR反應體系進行實驗：
| Reagent | 20 μl 體系 | 終濃度 |
| 2X SYBR Green Mix | 10 μl | 1X |
| RT Product | 2 μl | ? |
| Bulge-LoopTM miRNA Forward Primer (5 μM) | 0.8 μl | 200 nM |
| Bulge-LoopTM Reverse Primer (5 μM) | 0.8 μl | 200 nM |
| ddH2O | 至20 μl | ? |
注：1）正反向引物初始反應濃度推薦使用200nM，最佳濃度可以在100nM～500nM之間優化；
2）Bulge-LoopTM Reverse Primer為通用引物，與Bulge-LoopTM RT Primer的特異序列相匹配，與miRNA無關。U6或5S內參需選用各自特異的U6 RT Primer或5S RT Primer。
3）本試劑盒不含ROX染料，使用ABI PRISM? 7000/7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System 等需額外添加ROX染料作為校正熒光的儀器，請用戶自行準備所需的ROX染料。
2）建議使用標準三步法進行檢測，請在定量PCR儀（以Bio-Rad CFX96為例）上設定如下程序：
| 循環 | 步驟 | 溫度 | 時間 | 內容 |
| 1Ｘ | 預變性 | 95℃ | 10 min | Taq酶激活 |
| 40Ｘ | 變性 | 95℃ | 2 sec | PCR模板變性 |
|---|---|---|---|---|
| 退火 | 60℃ | 2 sec | 退火 | |
| 延伸 | 70℃ | 10 sec | 延伸 |
注：部分儀器如ABI系列儀器收集熒光信號需要較長的恒溫時間方能收集信號，使用此類儀器請將反應程序更改為兩步法，將退火及延伸反應合并，時間設置為儀器收集信號所需的最短時間。
3）對于用SYBR Green Ⅰ染料法進行的qPCR的檢測反應都需要在循環結束后立即進行融解曲線分析，檢測溫度為70℃~95℃，升溫速率為0.5℃/次，恒溫時間為5 sec/次。
