食道癌是一種全球致命的癌癥，5年總生存率為18%。食管癌的發病率、死亡率和組織病理學在不同的地理區域存在差異，特別是在東非/南非和東亞地區的居民負擔較高。腺癌和鱗狀細胞癌是兩種主要的組織學亞型，占食管癌的95%以上。在過去的幾十年中，這種癌癥的治療方法取得了一些進展。目前，需要開發針對食管癌發生的新療法。
非編碼RNAs（ncRNAs）包括長鏈ncRNAs、microRNAs（miRNAs）、tRNA衍生的小RNAs、piwi相互作用RNAs和假基因在所有人類腫瘤的發生和進展中發揮著重要的調節作用。最近，環狀RNAs（circRNAs）作為一種新興的內源性ncRNAs亞群，可以作為癌癥細胞周期、細胞凋亡、增殖、侵襲和遷移的關鍵調節因子。它們是通過pre-mRNA的反向剪接產生的，形成一個沒有5′-帽或3′-poly(A)尾的共價閉合環，并且由于其廣泛表達，相對較高的穩定性，以及在唾液、血液和外泌體中大量存在，因此，具有成為癌癥診斷和預后生物標志物的潛力。CircRNAs可以作為miRNA海綿來調節腫瘤的發病機制，包括鱗狀細胞癌。大多數研究集中在circRNAs在正常情況下的生物學作用。 circRNAs在低氧條件下的生物發生和功能仍不清楚。缺氧會破壞正常組織的穩態并重排腫瘤基質的相互作用。在缺氧的情況下，腫瘤細胞變得更容易遷移。已有研究報道缺氧可誘導腫瘤轉移。臨床上，腫瘤缺氧與對放療或化療的高耐藥性和預后不良有關。因此，探索缺氧條件下食管癌中的circRNAs具有重要意義。
鐵死亡是一種代謝應激誘導的細胞死亡，是由胱氨酸缺失和脂質活性氧（ROS）過度產生以鐵依賴性方式引起的，并與缺血性損傷和癌癥有關。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）通過還原谷胱甘肽（GSH）將脂質氫過氧化物還原為脂質醇，從而保護細胞免受膜脂質過氧化作用，并抑制鐵死亡。鐵死亡的形態學特征包括線粒體體積減少、線粒體嵴減少或缺失、線粒體外膜破裂、細胞核大小正常、無核濃縮，這與其他死亡模式有區別。由于癌細胞和正常細胞在鐵和脂質代謝方面表現出生理差異以及異常的ROS產生，因此癌細胞可能比正常細胞更容易受到鐵死亡的調節。已獲批準的藥物包括柳氮磺胺吡啶、索拉非尼、青蒿素和他汀類藥物可以誘導鐵死亡并抑制腫瘤生長。然而，鐵死亡作為一把雙刃劍，會在腫瘤微環境中引起免疫抑制，從而促進腫瘤生長。先前的一項研究表明，易遷移的癌細胞對鐵死亡高度敏感。另一項研究表明，缺氧可以保護腫瘤細胞免于鐵死亡。本研究揭示了食管癌細胞缺氧可激活鐵死亡，并探討了缺氧誘導的circRNA在鐵死亡中的作用及其潛在機制。
通過反向剪接反應生成的circRNAs受到外顯子跳躍事件和RNA結合蛋白（RBPs）的組合調控。RBPs包括ESRP1、ESRP2、PTBP1、TNPO1、RBM以及QKI，可以發揮剪接因子的功能來調節選擇性剪接。Quaking（QKI）屬于含KH結構域的STAR家族，可以影響pre-mRNA的剪接。將QKI的共有結合序列引入到側翼內含子會導致在正常情況下僅通過常規線性剪接的外顯子生成circRNAs。由于QKI可以形成二聚體，因此它被認為靶向側翼內含子并使環化的外顯子更靠近在一起，從而增加了circRNAs的生成。
近日，Molecular Cancer（IF41.444）期刊在線發表了題為CircBCAR3 accelerates esophageal cancer tumorigenesis and metastasis via sponging miR-27a-3p的研究論文。報道了一個在食管癌細胞中新鑒定的circRNA circBCAR3，其在食管癌組織和細胞中上調，并通過與miR-27a-3p結合上調TNPO1來加速食管癌的發生和轉移。此外，E2F7誘導的剪接因子QKI促進circBCAR3的生物發生。提示circBCAR3可能是食管癌治療的一個潛在靶點。
首先，研究人員從GEO數據庫中分析了circRNAs在食管癌中的表達?；贕SE150476和GSE112496數據集，發現有5個circRNAs在食管癌中差異表達。為了探索缺氧條件下食管癌中這些失調circRNAs的表達是否會發生改變，研究人員在缺氧處理后檢測了其在EC109細胞中的表達水平。結果發現缺氧處理后hsa_circ_0007624（circBCAR3）表達上調。PCR證實了circBCAR3在食管腫瘤標本和細胞系中表達明顯升高。隨后，研究人員對circBCAR3進行了表征，發現circBCAR3是由BCAR3 pre-mRNA（基因組位置chr1:94047857–94057950）的2、3、4、5外顯子反向剪接形成的閉環結構。RNA-FISH顯示circBCAR3主要存在于食管癌細胞的細胞質中。
Fig1. CircBCAR3在食管癌中表達上調
為了探討circBCAR3在食管癌發生發展中的作用，研究人員進行了功能缺失性實驗。結果顯示，沉默circBCAR3可抑制體外食管癌細胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡。此外，缺氧處理可顯著促進食管癌細胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡，而CircBCAR3敲低明顯逆轉了缺氧誘導的這些影響。
Fig2. 敲低circBCAR3可以在體外逆轉缺氧對食管癌細胞的影響
為了探索circBCAR3在體內腫瘤生長和轉移中的作用，研究人員構建了小鼠食管癌異種移植模型。結果顯示，circBCAR3缺失可降低小鼠食管腫瘤的體積和重量。此外，研究人員還建立了腫瘤轉移模型，通過尾靜脈注射食管癌細胞來監測肺轉移。結果發現，沉默circBCAR3可誘導小鼠腫瘤抑制，并且與對照組相比，沉默circBCAR3對食管癌肺轉移有抑制作用。HE染色進一步證實了這一趨勢。表明敲低circBCAR3減弱了體內食管腫瘤的生長和轉移。
Fig3. 敲低circBCAR3抑制體內食管癌生長和轉移
最后，研究人員通過生物信息學分析探索了circBCAR3的上游和下游機制，并通過RNA免疫沉淀和熒光素酶報告基因實驗進行驗證。結果發現，circBCAR3可以通過競爭性內源性RNA機制與miR-27a-3p相互作用，從而上調transportin-1（TNPO1）。此外，研究表明，剪接因子QKI是circBCAR3的正調節因子，通過靶向BCAR3 pre-mRNA中hsa_circ_0007624形成的外顯子側翼的內含子。RNA-seq分析發現缺氧誘導E2F7上調，E2F7在食管癌細胞中激活QKI的轉錄，QKI通過并置環狀外顯子來增加circBCAR3的形成。
Fig4. circBCAR3上游和下游機制模型示意圖
總之，本研究通過促進癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡以及促進小鼠食管腫瘤發生和轉移，創新性地證明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用。在分子水平上，缺氧誘導的E2F7轉錄激活剪接因子QKI，其通過與形成circBCAR3的外顯子側翼的內含子QKI反應元件結合來促進circBCAR3的生物發生。CircBCAR3與miR-27a-3p相互作用上調TNPO1，從而在食管癌細胞中發揮其生物學功能。這些數據表明circBCAR3可作為食管癌研究和治療的潛在標志物。
原文鏈接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01615-8#Sec23
本研究中使用到的miR-27a-3p mimic/inhibitor及其NC、EdU細胞增殖檢測試劑盒均由銳博生物提供！更多circRNA或miRNA研究產品與服務信息，歡迎登陸銳博生物官網（www.jyzfjx.com）進行查詢或來電咨詢！
