Hu抗原R（HUR）作為ELAV家族的成員，是最有名的RNA結合蛋白（RBP）之一，可以選擇性識別并結合富含腺苷酸/尿苷酸的元件（AREs）。AREs是哺乳動物細胞mRNA 3’UTR中腺苷酸尿苷酸富集區域，可介導mRNA的快速降解。HUR通過穩定其mRNA在轉錄后調節其靶基因，并參與細胞生長和腫瘤發生。
另一種常見的癌蛋白是熱休克蛋白90（HSP90），它是一種進化上保守的分子伴侶蛋白，在應激反應中參與穩定和激活蛋白。與正常組織相比，HSP90在腫瘤中過表達，其作為遺傳損傷緩沖劑的功能允許突變蛋白保留其功能，同時允許癌細胞耐受不平衡的微環境。
2020年6月29日，南京醫科大學第一附屬醫院束永前教授課題組在Molecular Cancer（IF15.302）期刊上發表了題為Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation的科研成果。發現circSHKBP1在GC患者的腫瘤和血清外泌體中均過表達，并且與晚期病理分期和較差的生存率相關。CircSHKBP1通過吸附miR-582-3p并誘捕HSP90來促進體內和體外的GC進程。 為GC的發病機理提供了一個新的見解。
circSHKBP1調控胃癌進展的作用示意圖
研究結果
1. 通過RNA-Seq鑒定GC中的circRNAs
通過對8個GC組織和8個匹配的相鄰正常組織的混合樣本進行RNA-seq，研究人員總共鑒定出1445個不同的候選circRNAs，其中至少有2個獨特的反向剪接連接reads。與正常組織相比，癌組織與正常組織間共有119個circRNAs差異表達，其中5個circRNAs上調，114個下調。進一步通過qRT-PCR分析了10對胃癌腫瘤和正常組織中前5個表達上調和下調的circRNAs，發現circSHKBP1是胃癌中差異表達最大的circRNA。
研究發現circSHKBP1是由SHKBP1基因的第11、12外顯子反向剪接產生，Sanger測序和RNase R消化實驗也證實了circSHKBP1以環狀形式存在。隨后，研究人員通過qRT-PCR檢測了circSHKBP1在72個配對的GC組織和正常組織中的表達，發現與匹配的正常組織相比，circSHKBP1在53個GC組織中表達上調。此外，研究人員還對152對胃癌患者的癌組織和正常組織進行ISH檢測。發現circSHKBP1在GC組織中的豐度遠遠高于匹配的正常組織，且circSHKBP1表達與晚期TNM分期、血管侵犯及預后不良相關。
體外實驗顯示，使用siRNA敲低circSHKBP1可顯著抑制GC細胞增殖、遷移和侵襲能力；過表達circSHKBP1則得到相反的結果。此外，研究人員發現外泌體circSHKBP1的增加是由于更多的circSHKBP1被裝載到外泌體中，而不是更多的外泌體被釋放。隨后，將提取的轉染了circSHKBP1質粒的BGC823和HGC27細胞培養液中的外泌體，與不同濃度未處理的GC細胞共培養。發現外泌體circSHKBP1的過表達也影響了GC細胞的增殖、遷移和侵襲，促進了惡性細胞的表型。
為了研究circSHKBP1在GC細胞中的作用機制。研究人員首先通過FISH和核質分離確定了circSHKBP1優先定位于GC細胞的細胞質內。又通過RIP實驗證實了circSHKBP1可充當miRNA海綿的作用。接著，預測了四個與circSHKBP1結合的潛在miRNA（miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458），并且發現在circSHKBP1過表達的GC細胞中，miR-582-3p和miR-665的表達下調。熒光素酶報告基因實驗和生物素標記的RNA pulldown實驗證實了circSHKBP1與miR-582-3p直接相互作用。qRT-PCR檢測發現miR-582-3p在GC腫瘤中的表達水平低于配對正常組織，且miR-582-3p與circSHKBP1的表達呈負相關。表明circSHKBP1作為miR-582-3p的海綿，降低了miR-582-3p的表達。進一步的miR-582-3p生物學功能研究顯示miR-582-3p mimic抑制了GC細胞的增殖、遷移和侵襲，而circSHKBP1的過表達則消除了這種抑制作用。
臨床數據分析顯示高circSHKBP1組的血管侵犯率明顯高于低circSHKBP1組。通過生物信息學分析發現了54個miR-582-3p候選靶蛋白，其中HUR和EIF2S1被報道為VEGF信號通路的一部分。VEGF是促進內皮細胞增殖的重要因素之一，因此研究人員對VEGF途徑進行了深入研究。
western blot檢測顯示過表達circSHKBP1增加了HUR和VEGF的水平，但對EIF2S1的水平沒有影響。此外，miR-582-3p mimic可降低HUR和VEGF蛋白水平的升高。同樣，沉默circSHKBP1可以降低HUR和VEGF的水平，而miR-582-3p inhibitor可以恢復這些水平。HUR作為VEGF信號通路中的重要元件，可通過與VEGF mRNA的AREs結合，從而穩定mRNA結構并誘導VEGF翻譯。RIP實驗證實了HUR是miR-582-3p的靶點，并且HUR直接與VEGF mRNA結合。此外，還發現HUR表達與miR-582-3p負相關，與circSHKBP1正相關。
使用特異性生物素標記的circSHKBP1探針進行RNA pulldown發現circSHKBP1過表達GC細胞中有多條蛋白條帶富集。蛋白質譜分析用于鑒別差異表達的蛋白，排名前2位的分別是HSP90β和HSP90α蛋白（HSP90的兩種亞型）。RIP實驗證實了circSHKBP1與HSP90直接相互作用。TCGA分析、qRT-PCR和ELISA檢測發現HSP90 mRNA和蛋白在胃癌中表達上調，且HSP90蛋白表達與circSHKBP1呈正相關。Western blotting顯示circSHKBP1過表達后HSP90總量略有增加。然而，用CHX抑制蛋白質合成后，circSHKBP1過表達可顯著抑制HSP90的降解。
為了研究CircSHKBP1在體內的功能，研究人員構建了穩定沉默circSHKBP1和穩定過表達circSHKBP1的細胞株，然后將細胞皮下接種于裸鼠右大腿，密切監測腫瘤生長。結果發現敲低circSHKBP1可限制腫瘤生長，無論是腫瘤體積還是腫瘤重量/體重比；過表達circSHKBP1使得產生的腫瘤更大、更重，而注射貝伐單抗可顯著抑制腫瘤生長。通過對小鼠血清和腫瘤中的蛋白進行western blot分析，發現circSHKBP1沉默組的HUR和VEGF水平下降；circSHKBP1過表達組的HUR和VEGF升高，而貝伐單抗抑制VEGF。
