mRNA與ncRNA逆轉錄實驗，有它就夠啦！

逆轉錄（Reverse Transcription）是以RNA為模板合成DNA的過程。逆轉錄過程是RNA病毒的復制形式之一，需逆轉錄酶的催化。通過體外模擬該過程，以樣本中提取的RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成出互補的cDNA，構建cDNA文庫，并從中篩選特異的目的基因。該方法已成為基因工程技術中最常用的獲得目的基因的策略之一。

體外逆轉錄反應結合PCR或逆轉錄PCR（RT-PCR），即使在基因表達水平非常低的情況下也能檢測到RNA，如循環RNA、RNA病毒等，cDNA也可用作微陣列和RNA測序等應用中的模板，以高通量方式表征未知的RNA。

逆轉錄實驗操作相對來說比較簡單，下面小編就以銳博生物riboSCRIPTTM 逆轉錄試劑盒為例，給大家介紹一下RNA逆轉錄的實驗方法及注意事項！

首先，這款RNA逆轉錄試劑盒是長這樣的~~~

? ?它結合了新一代高效逆轉錄酶，最大限度地去除了RNase H活性，提高了cDNA合成的產率和熱穩定性；

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? ?它適用于mRNA、lncRNA、miRNA等RNA的逆轉錄反應；

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? ?它逆轉錄的cDNA可長達12.3kb。

因不同類型的轉錄本需搭配不同的逆轉錄引物，該試劑盒還可搭配提供RT引物。一般情況下，mRNA推薦搭配oligo(dT)；lncRNA推薦使用Random Primer & Oligo (dT)或者特異性逆轉錄引物；miRNA推薦搭配銳博生物的Bulge-LoopTM miRNA RT Primer進行逆轉錄。

試劑盒組分：

表 1 試劑盒組分清單

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運輸保存：

產品為低溫運輸。收到產品后，請于-20℃保存，可以穩定保存一年以上。使用前請瞬時離心。

使用前須知：

1）為避免外界因素(包括酶、極端pH或者溫度條件等)導致產品降解，所有操作請嚴格遵循DNA和RNA操作規程。實驗過程中，產品請于冰上放置，使用完畢后請于-20℃以下小心保存。

2）血漿/血清/外泌體的mRNA/lncRNA/ miRNA qRT-PCR檢測需要在提取RNA前加入外參，銳博生物推薦秀麗隱桿線蟲miRNA（cel-miR-39-3p）或擬南芥miRNA（ath-miR156a-5p）的標準品作為外參模板。

3）miRNA qPCR推薦搭配銳博生物的配套引物和試劑盒進行實驗，其他公司的qPCR試劑盒請核實使用方法。

實驗方法：

注：

1）不同類型的轉錄本需搭配不同的逆轉錄引物，具體請見使用前說明。如果待測轉錄本為mRNA/lncRNA，1μg total RNA建議使用終濃度為2.5μM的oligo dT或20μM的Random Primer進行逆轉錄；如果待測轉錄本為miRNA，最佳miRNA RT引物濃度依據具體實驗而定，引物濃度范圍可在200nM～800nM之間優化；

2）反應體系可按需求相應放大，20μl反應體系可最大使用5g的Total RNA。

2. 以上體系后混合均勻后，瞬時離心，RT反應程序為：42℃ 60 min，70℃ 10 min。

注：1）反應后的RT產物最好盡快進入后續的PCR檢測。如條件不允許，可暫存于4℃冰箱。但如需要長期存放，請放置于-20℃冰箱。

FAQ：

1. RT前是否可以對RNA進行高溫變性處理？

高溫變性處理主要是為了打開RNA的二級結構，可以在RT前將RNA與逆轉錄引物混和在 70℃中變性10min，然后冰浴2min再進行RT反應，但高溫處理可能會造成RNA發生不同程度的降解。

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