胰腺β細胞功能障礙有助于2型糖尿病的發病機制。MiR-21已被證明在葡萄糖不耐受患者和2型糖尿病小鼠的胰島中被誘導。然而，miR-21在胰腺β細胞功能調控中的作用在很大程度上仍然不明確。2022年6月21日，Nature Communications期刊（IF14.919）在線發表了題為MicroRNA-21 promotes pancreatic β cell function through modulating glucose uptake的研究論文。報道了胰島β細胞中的miR-21通過miR-21-Pdcd4-AP-1依賴性途徑上調Glut2表達，從而增強葡萄糖攝取，進而促進胰島素分泌的分子機制。該研究結果進一步加深了我們對miR-21在調節胰腺β細胞功能和T2D發展中的作用的理解。
研究結果：
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1、高糖和高脂聯合上調胰島miR-21的表達
之前的研究表明，胰島β細胞中的miR-21可能在1型糖尿?。═1D）的發展過程中發揮重要作用。為了研究miR-21在T2D發展過程中的作用，研究人員首先檢查了其在體外高糖、高脂或兩者組合處理的小鼠胰島中的表達。結果顯示，高糖高脂聯合處理（而非高糖高脂單獨處理）的小鼠胰島顯著上調了miR-21的表達。接下來，研究人員在體內檢測了miR-21在葡萄糖和/或毒性條件下的表達。結果發現，與對照小鼠相比，糖尿病db/db小鼠（而非ob/ob小鼠）胰島中的miR-21表達顯著增加。以上結果表明胰島miR-21的表達在高糖高脂聯合（而非單獨高脂）條件下上調。
Fig1. 高糖高脂聯合上調胰島miR-21表達
2、miR-21的遺傳缺失導致葡萄糖刺激的胰島素分泌受損
為了探索miR-21在調節胰腺β細胞功能中的作用，研究人員從野生型（WT）和常規miR-21缺陷小鼠（miR-21KO）中分離出胰島，并在葡萄糖存在的情況下進行體外培養。結果發現，雖然胰島素分泌的基礎水平（2.8?mM葡萄糖）相當，但當暴露于高濃度（16.7mM）葡萄糖時，缺乏miR-21的胰島表現出胰島素分泌的顯著降低。隨后，研究人員生成了胰腺β細胞特異性缺失miR-21的小鼠模型Ins2-Cre miR-21f/f（miR-21βKO），以進一步研究miR-21在胰島β細胞中的作用。結果顯示，3、7、10和27周齡的miR-21βKO小鼠在腹腔內葡萄糖耐量試驗（IPGTT）中受到挑戰時，葡萄糖耐量顯著受損。此外，miR-21βKO小鼠的葡萄糖耐受不良伴隨著葡萄糖負荷后血清中胰島素濃度的降低。以上結果表明，miR-21在胰島β細胞中是胰島素分泌的正調節因子，其缺失會損害胰島素分泌。
Fig2. 胰腺β細胞特異性缺失miR-21的小鼠表現出血糖耐量和胰島素分泌受損
3、miR-21βKO胰島中參與胰島素分泌的細胞通路受損
為了研究miR-21如何增強胰島素分泌，研究人員對WT和miR-21βKO小鼠的胰島進行了mRNA測序分析。結果鑒定出597個基因表達上調，293個基因表達下調。GO分析顯示差異表達的基因類型聚集成與胰島素分泌相關的特定功能類別。miR-21βKO胰島中上調的基因聚集成鉀離子轉運、葡萄糖輸入的負調節、跨膜轉運的負調節和分泌的負調節，下調的基因聚集成對葡萄糖響應、鈣輸入、鈣依賴性胞吐作用、胰島素分泌和細胞內轉運。在獲得的熱圖中給出了代表性mRNA水平的改變。這些數據表明，miR-21βKO胰島中參與胰島素分泌的細胞通路受損。
Fig3. WT和miR-21βKO小鼠胰島的轉錄組學分析
4、miR-21βKO小鼠的胰島表現出葡萄糖攝取受損
為了進一步確定哪些特定通路受miR-21缺失的影響，研究人員檢查了葡萄糖6-磷酸（G6P）的產生，這是葡萄糖代謝的一個關鍵中間體。結果顯示，當暴露于高濃度葡萄糖時，miR-21βKO小鼠的胰島產生的G6P顯著減少。為了進一步證明miR-21在葡萄糖攝取或/和葡萄糖代謝中發揮重要作用，研究人員檢測了胰島暴露于葡萄糖時的氧消耗（OCR）。結果發現miR-21βKO小鼠的胰島對葡萄糖添加的反應明顯降低。使用葡萄糖攝取測定，進一步證明了miR-21βKO胰島的葡萄糖代謝降低是由于葡萄糖攝取缺陷，這可以通過miR-21βKO胰島中 NBD-葡萄糖的細胞內熒光強度降低來支持這一結果。
Fig4. miR-21βKO小鼠的胰島表現出葡萄糖攝取受損
5、miR-21通過上調Glut2表達改善胰島素分泌
Glut蛋白是一組廣泛的跨膜蛋白，可促進葡萄糖跨質膜的轉運。為了確定miR-21促進葡萄糖攝取的通路，研究人員檢測了體外葡萄糖刺激下WT和miR-21βKO胰島中5個重要Gluts的mRNA表達。結果表明，Glut2在胰島中的表達水平最高，在miR-21βKO小鼠胰島中的表達顯著降低。其他Gluts的表達水平要么很低，要么無顯著差異。此外，研究人員從WT和miR-21βKO胰島中分離出胰島β細胞，并證實了Glut2 mRNA表達在miR-21缺陷型β細胞中降低。進一步的實驗證明了miR-21βKO小鼠胰島中的Glut2蛋白表達顯著降低。轉錄組學分析也證實了Glut2（Slc2a2）在miR-21βKO胰島中的表達降低。
為了確定Glut2表達降低是否是miR-21βKO胰島胰島素分泌缺陷的原因，研究人員測試了Glut2的異位表達是否可以挽救在miR-21βKO小鼠胰島中觀察到的功能缺陷。結果顯示，miR-21βKO胰島中Glut2異位表達導致Glut2 mRNA水平完全恢復，并挽救了胰島素分泌以響應16.7mM葡萄糖。這些結果表明，miR-21通過上調Glut2表達來促進胰島素分泌。
Fig5. miR-21通過上調Glut2表達改善胰島素分泌
6、miR-21通過miR-21-Pdcd4-AP-1通路促進Glut2表達
以前的研究表明，AP-1與Glut2的啟動子結合并正向調節Glut2的表達。另一方面，程序性細胞死亡4（Pdcd4）是miR-21的一個經過充分研究的靶標，是AP-1活性的負調節因子。為了研究miR-21如何調節Glut2表達，研究人員檢查了Pdcd4和AP-1的表達是否在miR-21βKO胰島中發生改變。結果顯示miR-21βKO小鼠胰島中Pdcd4的mRNA和蛋白水平均升高，而AP-1亞基c-Jun的表達顯著降低。
為了檢測Pdcd4對Glut2表達的直接影響，研究人員使用Pdcd4特異性siRNA敲低β-TC-6細胞中Pdcd4的表達，發現在有效敲低Pdcd4表達的同時，Glut2蛋白水平顯著升高。為了驗證AP-1對胰腺β細胞Glut2表達的調控作用，研究人員首先構建了小鼠Glut2啟動子報告基因，并與對照組或表達c- jun的質粒共轉染β-TC-6細胞。結果顯示，c-Jun過表達時，Glut2啟動子活性顯著增強。隨后，研究人員檢查了AP-1活性的改變是否會影響胰腺β細胞中的Glut2表達。結果表明，β-TC-6細胞中c-Jun的異位過表達增加了Glut2的mRNA和蛋白質水平，但用AP-1特異性抑制劑抑制胰島中的AP-1活性則降低了它們的水平。這些數據表明miR-21在胰腺β細胞中可能通過miR-21-Pdcd4-AP-1-Glut2通路促進Glut2的表達。
Fig6. miR-21通過miR-21-Pdcd4-AP-1通路促進Glut2表達
7、遞送miR-21至2型糖尿病小鼠的胰腺可降低血糖水平
由于已經確定miR-21作為胰島β細胞中胰島素分泌的正調節因子，接下來研究人員試圖探索增加miR-21的水平是否可以改善胰島素分泌，從而降低血糖水平。首先使用腺病毒在體外增加胰島中的miR-21水平。結果顯示，在小鼠胰島中過表達miR-21后，miR-21水平和Glut2 mRNA表達顯著增加。更重要的是，腺病毒介導的miR-21升高顯著增加了葡萄糖誘導的胰島素分泌。當使用人類胰島時發現了類似的結果。此外，研究人員發現在小鼠insulin-1啟動子控制下，腺病毒介導的小鼠胰島中的miR-21過表達也增加了Glut2 mRNA表達和葡萄糖誘導的胰島素分泌。
Fig7. 胰島中miR-21表達的增加可促進Glut2表達和葡萄糖刺激的胰島素分泌
接下來，研究人員試圖確定在體內提高胰島中miR-21的水平是否可以降低血糖水平。首先通過靜脈注射將Control或miR-21 agomir注射到6周齡2型糖尿病db/db小鼠體內，然后測量體重/血糖水平。結果發現，增加胰腺中miR-21水平可以顯著降低血糖水平，而體重、體脂百分比和血脂水平沒有受到影響。通過檢測Glut2 mRNA水平僅在胰腺中增加證實了miR-21在胰腺中特異性發揮作用。此外，進一步的實驗證實了胰腺中的Glut2蛋白水平也增加了。此外，研究發現給藥miR-21 agomir后血清中的胰島素濃度顯著增加。這些數據表明，提高胰腺中miR-21水平能夠促進Glut2表達和胰島素分泌，從而顯著降低血糖水平。
Fig8. 遞送miR-21到2型糖尿病db/db小鼠胰腺可降低血糖水平
總之，本研究結果表明，胰島β細胞中的miR-21可促進胰島素分泌，并支持miR-21在調節2型糖尿病胰腺β細胞功能中的作用。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-31317-0
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