結直腸癌（CRC）是全球癌癥相關死亡的主要原因。外泌體已成為細胞間通訊的關鍵調節因子，并且外泌體中富含豐富的環狀RNAs（circRNAs）。circRNAs是調節癌癥增殖和進展的非編碼RNA的新成員。然而，癌癥來源的外泌體circRNAs在CRC中的功能和調控機制尚不清楚。近期，Molecular Cancer（IF27.403）期刊在線發表了題為Exosomal circPACRGL promotes progression of colorectal cancer via the miR-142-3p/miR-506-3p- TGF-β1 axis的研究論文。報道了一種新的CRC來源的外泌體circRNA circPACRGL，首次揭示了癌癥來源的外泌體circPACRGL在CRC增殖和轉移中發揮致癌作用，為circRNAs在CRC進展中的作用提供了機制見解，并為CRC治療提供了有價值的標志物。
circPACRGL在癌癥進展中通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸調節N1-N2中性粒細胞分化的模型示意圖
主要研究結果
??CRC來源的外泌體可增強CRC的增殖、遷移和侵襲
之前的研究表明癌癥來源的外泌體與腫瘤的增殖和轉移功能有關。為了探索外泌體在CRC中的機制，研究人員從兩種CRC細胞系HCT116和SW480的上清液中分離出癌細胞來源的外泌體。通過TEM和NTA分析發現外泌體為圓形顆粒，大小約為80-100 nm，具有雙層膜，與外泌體的常見尺寸一致。western blot檢測到外泌體特異性標記物CD9、CD54和Annexin的表達，以及GM130表達的顯著降低。
接下來，研究人員探索了外泌體是否影響CRC細胞的增殖、遷移和侵襲。CCK8實驗顯示外泌體顯著增強了CRC細胞增殖。流式細胞術分析顯示外泌體刺激的CRC細胞中凋亡細胞的百分比顯著降低。此外，劃痕實驗和transwell實驗表明CRC細胞的外泌體可以顯著促進CRC細胞的遷移和侵襲。體內轉移模型顯示外泌體治療顯著增加了HCT116細胞的轉移。表明CRC來源的外泌體促進了CRC的增殖、遷移和侵襲。
??circPACRGL在添加了腫瘤來源外泌體的CRC細胞中顯著上調
據報道，腫瘤來源的外泌體中富含circRNAs。為了鑒定CRC相關的circRNAs，研究人員通過RNA測序分析了由三對外泌體刺激的HCT116和SW480細胞（Ex-HCT116和Ex-SW480）以及每對未處理對照細胞組成的表達譜。差異表達分析結果及RT-qPCR驗證發現circPAGRAL(也稱為has_circ_0069313)是兩個ex組中上調最多的基因，且外泌體刺激的CRC細胞中circPAGRAL水平持續且顯著增加。
然而，這一結果與使用CRC患者血清源性外泌體（Serum-EXO）處理的CRC細胞不一致。猜測circPACRGL在血清外泌體中的表達差異可能與腫瘤組織特異性和患者背景有關。因此，研究人員進一步從CRC患者的腫瘤組織中分離出外泌體，發現circPAGRAL的表達在經腫瘤來源外泌體（Tumor-EXO）處理的CRC細胞中顯著上調。表明circPACRGL可能來源于腫瘤來源的外泌體。隨后的功能缺失性實驗顯示，circPACRGL siRNA轉染HCT116和SW480細胞后，導致circPACRGL表達明顯降低。然而，在與腫瘤來源的外泌體共同處理后，兩個CRC細胞中的circPACRGL mRNA表達顯著增加。證明circPACRGL主要來源于腫瘤來源的外泌體，而不是腫瘤細胞內的表型變化。
??circPACRGL作為miR-142-3p和miR-506-3p的海綿
FISH實驗顯示circPACRGL主要分布在HCT116和SW480細胞的細胞質中。因此，研究人員通過數據庫預測了與circPACRGL相關的潛在miRNAs，發現circPACRGL同時具有miR-142-3p和miR-506-3p的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實miR-142-3p和miR-506-3p是circPACRGL的靶標。此外，miR-142-3p和miR-506-3p在CRC細胞源性外泌體刺激的HCT116和SW480細胞中的表達均顯著降低。表明circPACRGL可以作為miR-142-3p和miR-506-3p的海綿。
??TGF-β1是miR-142-3p/miR-506-3p的共同靶點
MiRNAs可以與基因的3’UTR結合，調節mRNA和蛋白質的表達。因此，研究人員通過數據庫預測miR-142-3p和miR-506-3p的靶基因，發現TGF-β1參與了腫瘤的發生發展，并與N1/N2中性粒細胞的分化有關，是最好的候選靶基因之一。熒光素酶報告基因實驗進一步證實了TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p的共同靶基因。Western blot和qRT-PCR分析顯示，miR-142-3p/miR-506-3p mimic轉染可顯著降低TGF-β1蛋白和mRNA水平。進一步的實驗發現加入CRC來源的外泌體后，CRC細胞中TGF-β1的蛋白和mRNA水平均顯著升高，而miR-142-3p/miR-506-3p inhibitor聯合治療后，TGF-β1的上調作用被有效抑制。表明TGF-β1是mir-142-3p和miR-506-3p的共同靶點。
??circPACRGL通過調控miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸促進CRC的增殖、遷移和侵襲
基于上述結果，研究人員推測circPACRGL可能通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸調節CRC的增殖、遷移和侵襲。CCK8結果顯示，CRC源性外泌體處理（Ex-HCT116）組中CRC細胞的增殖有效增加。敲除circPACRGL顯著降低了CRC細胞增殖，而在miR-142-3p/miR-506-3p inhibitor處理或TGF-β1過表達后，這種抑制作用減弱。在細胞凋亡檢測中觀察到類似的結果。此外，劃痕實驗和transwell實驗都表明，CRC來源的外泌體增強了CRC細胞的遷移和侵襲能力，在circPACRGL敲低細胞中則發生了相反的效果。但CRC來源的外泌體處理可以挽救circPACRGL敲低細胞受損的遷移和侵襲能力。并且miR-142-3p/miR-506-3p inhibitor處理或TGF-β1過表達可顯著促進CRC源性外泌體處理的circPACRGL敲低細胞的遷移和侵襲。以上實驗結果證實了circPACRGL通過調節miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸促進CRC的增殖、遷移和侵襲。
??CRC來源的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸調節N1-N2中性粒細胞的分化
據報道，高水平的TGF-β1與腫瘤的發展以及從N1到N2中性粒細胞的表型轉換有關，而促腫瘤發生的N2中性粒細胞可以促進腫瘤的增殖和轉移。本研究結果顯示circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸促進CRC進展。因此，研究人員進一步探索了CRC來源的外泌體circPACRGL是否也通過該軸調控中性粒細胞的N1-N2分化。
研究結果顯示CRC來源的外泌體可以增加N2中性粒細胞的百分比，這與N2標志物CD11b+/Ly6G+/Ly6Clow的上調一致。相比之下，circPACRGL敲低細胞組中N2中性粒細胞的百分比顯著降低，而在添加CRC來源的外泌體后，這種抑制作用被消除。然而，miR-142-3p/miR-506-3p inhibitor處理或TGF-β1過表達可以顯著加速用CRC源性外泌體處理的circPACRGL敲低細胞中N1-N2的分化。證實了CRC來源的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸調節N1-N2中性粒細胞的分化。
總之，本研究結果表明，circPACRGL在CRC細胞存活和轉移中發揮致癌作用，為研究circRNAs在CRC治療中的作用提供了新的理論基礎。
原文鏈接：https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-01235-0
本研究中的外泌體RNA測序服務、miRNA mimic或inhibitor及其NC對照產品均由銳博生物提供！
