肝細胞癌（HCC）是原發性肝癌最常見的亞型，也是全球癌癥相關死亡的主要原因之一。為了深入了解HCC的轉錄組學圖譜和分子機制，鄭州大學的研究人員在Oncogene（IF9.86）期刊上發表了題為Whole-transcriptome and proteome analyses identify key differentially expressed mRNAs, miRNAs, lncRNAs and circRNAs associated with HCC的研究論文?；谌D錄組和蛋白質組分析結果以及對目標轉錄本的預測，建立了一個可指示關鍵mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA相互作用的ceRNA網絡，并闡明了ceRNA網絡中這些轉錄本之間的調控相互作用，為預測HCC患者的預后以及新的治療靶點提供了潛在的生物標志物。
實驗設計流程圖
主要研究結果
? HCC腫瘤及鄰近非癌組織中差異蛋白的篩選
首先，研究人員使用串聯質譜標簽（TMT）和RNA-Seq對5對HCC腫瘤和鄰近非癌組織進行了全面的轉錄組學和蛋白質組學研究。共鑒定了5351個蛋白質，977個差異表達蛋白（DEPs），其中大多數蛋白質表達上調（621個），少數蛋白質表達下調（356個）?；鹕綀D分析顯示出顯著差異，顯著失調基因的熱圖分析顯示出HCC和對照組織之間聚類的基因表達模式。
??DEmRNAs、DEmiRNAs和DElncRNAs的鑒定
為了進一步確定調控網絡，研究人員同時對HCC患者的腫瘤和癌旁正常肝組織進行了比較轉錄組學研究。結果鑒定了243個DEmRNAs（33個上調和210個下調）、130個DEmiRNAs（102個上調和28個下調）、29個DElncRNAs（5個上調和24個下調）和895個DEcircRNAs（840個上調和55個下調）。熱圖分析顯示癌癥樣本與對照樣本顯著分開。
??miRNAs、lncRNAs靶基因及circRNAs親本基因的功能富集分析
為了深入了解數據中鑒定和量化的蛋白質，研究人員通過對circRNAs的親本基因以及miRNAs和lncRNAs的靶基因進行GO和KEGG通路分析，對其功能和特征進行了詳細的注釋。生物過程（GO-BP）結果表明它們主要富集于GO:0005515蛋白結合和GO:0097159有機環狀化合物結合。此外，KEGG通路分析顯示miRNAs和lncRNAs的靶基因在代謝通路和許多信號通路中富集，包括mTOR、AMPK、Ras和Wnt信號通路。circRNAs的親本基因主要參與代謝過程，包括纈氨酸亮氨酸異亮氨酸降解和脂肪酸降解。
??HCC腫瘤和肝組織中失調的生物學功能
隨后，研究人員對DEPs的亞細胞結構進行了預測和分類。結果顯示DEPs的分子功能主要分布在結合和催化活性上。DEPs在氧化還原酶活性、RNA加工和細胞氨基酸分解過程中富集。KEGG通路分析表明，最顯著的通路是剪接體、酪氨酸代謝和脂肪酸降解。另一方面，差異表達基因（DEGs）主要在各種代謝過程中富集。
??蛋白質組學與轉錄組學的相關性分析
接著，研究人員對蛋白質組與轉錄組進行了相關性分析，從977個DEPs和234個DEmRNAs中共鑒定出56個具有共同變化的蛋白質和基因。其中，52個DEG-DEPs共同下調，只有14-3-3蛋白sigma（SFN）和epiplakin（EPPK1）2個DEG-DEPs共同上調。此外，蛋白質與其相應基因之間的關聯性較低。共有617個DEPs被鑒定為蛋白質上調但基因未改變，304個DEPs被鑒定為蛋白質下調但mRNA不變，153個DEmRNAs被鑒定為mRNA下調但蛋白質不變。GO和KEGG富集分析結果表明DEP-DEG的分子功能和生物學過程主要富集在氧化還原酶活性、RNA結合、細胞氨基酸分解代謝過程、含氧酸代謝過程和RNA加工。
根據蛋白質/mRNA表達水平的差異（增加、保持不變或減少），研究人員將DEG/DEPs分為四組：蛋白質水平下調但RNA水平不變；RNA水平下調但蛋白質水平不變；蛋白質和RNA水平均下調；蛋白質水平上調但RNA水平不變（排除共同上調的DEG-DEP組，因為該組中只有兩個基因）。然后進行功能富集分析，以檢測DEPs是否在某些功能類型中具有顯著的富集趨勢。富集分析結果如下面熱圖所示：
??HCC中ceRNA網絡的構建
接下來，研究人員結合來自全轉錄組測序的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA數據來構建ceRNA調控網絡。首先，使用TargetScan、miRDB、miRTarBase和miRWalk預測miRNA-mRNA對。只有存在于四個數據庫中的三個以上的miRNA-mRNA相互作用才被納入ceRNA網絡中。然后，篩選出與miRNAs具有相反表達趨勢的基因。采用MiRanda、PITA和RNAhybrid預測lncRNA-miRNA對。最后，分析mRNA-lncRNA和mRNA-circRNA對的共表達，并繪制ceRNA網絡圖。結果顯示，ceRNA網絡中總共包含18個lncRNAs、36個mRNAs和54個miRNAs。
為了建立篩選出的HCC中蛋白質和RNA水平均下調的DEP-DEGs的調控網絡，研究人員還分析了前10個DEP-DEGs的ceRNA網絡，其中包括4個lncRNAs、7個mRNAs和16個miRNAs，并繪制ceRNA網絡圖進行可視化。此外，選擇靶向16個miRNAs的circRNAs，并與7個mRNAs的mRNAs共表達。最后，構建可視化circRNA-miRNA-mRNA網絡。
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??鑒定具有預后價值的關鍵基因和miRNAs的特征
蛋白質組學結果顯示，與鄰近正常組織相比，HCC腫瘤中AKR1B10（醛酮還原酶家族1成員B10）、SULT1C2（磺基轉移酶1C2）和ACSL4（長鏈脂酰輔酶A合成酶4）的表達顯著增加。western blotting結果顯示AKR1B10、SULT1C2和ACSL4的表達顯著高于對照組。ROC曲線分析結果顯示，AKR1B10和EPPK1的AUC>0.7，SULT1C2、ACSL4和SFN的AUC>0.8。生存分析顯示，AKR1B10、SULT1C2或SFN高表達的患者生存率較低。
此外，通過對數秩檢驗和Cox回歸結果發現，16個miRNAs中有5個miRNAs（hsa-miR-1266-5p、hsa-miR-128-1-5p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-34b-3p hsa-miR-570-3p）和3個lncRNAs（LINC01093、LINC02037和C3P1）在Kaplan-Meier生存曲線方面存在顯著差異，表明組間生存時間分布差異具有統計學意義。
總之，本研究結合了蛋白質組學和轉錄組學研究，以探索潛在的癌癥生物標志物，并發現新的治療靶點。通過對腫瘤HCC及鄰近正常組織中的DEPs和RNAs（lncRNAs、circRNAs、mRNAs和miRNAs）進行分析，然后構建ceRNA網絡。研究人員鑒定了3個在HCC中顯著過表達的蛋白質（AKR1B10、SULT1C2和ACSL4）、ceRNA網絡分析的前10個hub基因，以及3個lncRNAs（LINC01093、LINC02037和C3P1）和5個miRNAs（has-miR-1266-5p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-570-3p、hsa-miR-139-5p和hsa-miR-128-1-5p）調節HCC癌變和進展。這些發現不僅為進一步了解HCC提供了有價值的資源，而且在這個精準醫學時代具有變革意義，有助于確定HCC的潛在臨床診斷和治療靶點。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41388-021-01908-0
本研究中的全轉錄組測序（RNA sequencing）服務由銳博生物提供！
