siRNA體內應用考慮因素
動物體內生理環境非常復雜，動物用siRNA（又稱in vivo siRNA）一般必須要提高其在體內的穩定性、半衰期、靶向性、純度、藥活性以及降低毒性等才可以用于體內實驗，通常需要采用特殊的化學修飾或制備工藝以實現上述的目的
① 穩定性，siRNA 易被酶降解，難以在體內持續發揮作用。
② 安全性，siRNA 非特異作用引起“脫靶” 效應，同時外源RNA 引發免疫反應。
③ 給藥方式，必須提高 siRNA 生物利用度，有效作用于病變區域。
銳博生物采用自主專利siRNA化學修飾技術，原料采用高品質進口原料，通過嚴格質量檢測控制體系，有效增強in vivo siRNA的穩定性，具有良好siRNA血清穩定性，并保持siRNA高效活性，降低免疫原性，更大限度降低siRNA對實驗動物毒性，最大限度滿足給藥要求，有效提高in vivo siRNA生物利用度，每批次均可質量溯源和提供完整質量文件。
產品優勢
■ 穩定化學修飾，有效保護 siRNA 不受核酸酶降解
■ 精確序列設計，有效降低“脫靶效應”
■ 獨特化學修飾，有效降低免疫反應
■ 高效化學修飾，提高生物利用度
■ 已經脫鹽、去內毒素處理，可直接注射于實驗動物
■ 合成規格可達100g級以上
應用范圍
■ RNAi 治療藥物開發
■ 藥物靶標體內鑒定和確認
■ 基因功能體內研究
■ 富含核酸酶環境下的 RNAi 實驗
常用化學修飾方式
?圖1? siRNA常用化學修飾位點和常用的化學修飾方式
?常用siRNA化學修飾方式
|
修飾方式 |
修飾類型 |
主要功能 |
|
2’-OMe FC（氟代） FU（氟代） |
核糖修飾 |
增強抗核酸酶活性的能力，提高siRNA穩定性 |
|
PS（硫代磷酸） |
磷酸骨架修飾 |
增強抗核酸酶活性的能力，提高siRNA穩定性 |
|
5’-Cy3 3’-Cy3 5’-Cy5 3’-Cy5 |
熒光染料標記 |
優化各種細胞的轉染條件，跟蹤細胞或動物體內siRNA的吸收及分配 |
|
5’-Chol（膽固醇） 3’-Chol（膽固醇） |
末端連接 |
促進細胞對siRNA的吸收，延長siRNA在血清中的半衰期 |
|
5’-Phosphate 5’-Biotin-linker 3’-Biotin-linker 5’-Thiol-linker 3’-NH2 -linker |
末端連接 |
用于RNAi機理和生物學等研究 |
|
5’-維生素E-linker 5’-葉酸-linker 5’-膽酸-linker 5’-PEG-linker |
末端連接 |
提高機體對siRNA靶向性吸收，延長siRNA在血清中的半衰期等 |
給藥方式與給藥劑量參考
給藥方法大致分為系統給藥（如靜脈給藥、腹腔給藥等）和局部給藥（如皮下注射，玻璃體給藥，鞘內給藥等）。首先需要根據動物模型和實驗方案，確定給藥量和給藥次數，然后計算出實驗所需的總用量。需要根據不同的器官來選擇給藥方法，而給藥量因不同給藥方法和實驗目的而異。如肝臟、腎臟、肌肉等常用靜脈注射（系統給藥）；而皮下腫瘤則常用到瘤內注射（局部給藥）。對于in vivo siRNA，推薦系統給藥每次注射5~20nmol/20g體重，局部給藥則需每次注射1~10nmol，給藥頻率往往是一周2~3次，可以根據實驗研究目的靈活調整給藥方案。
in vivo siRNA給藥方式示意圖
（如：口服、靜脈注射、皮下注射、眼內注射、腦室內注射、肌肉注射、椎管內注射、皮內注射、淋巴腔注射、鼻腔注射、舌下注射、腹腔注射等）
口服給藥：安全方便，經胃腸道吸收，這類化合物利用率最低；
腹腔給藥：不存在胃腸道首過代謝，但依然存在肝臟首過代謝，生物利用率較高；
靜脈給藥：不存在吸收屏障和首過代謝屏障，生物利用度最高；
皮下注射和肌肉注射：經皮下和肌肉毛細管吸收，吸收沒有靜脈注射完全，但可避開胃腸道和肝臟首過代謝；
皮內注射：把siRNA藥液注射入表皮和真皮之間，皮內注射吸收較慢；
腦內注射：精確注射藥物進入大腦腦室或大腦特定組織，如海馬體、黑質等，跳過藥物吸收和血腦屏障，給藥體積很小。
從生物利用度的角度，靜脈給藥最高，依次是靜脈給藥>腹腔>肌肉>皮下>口服。
動物實驗文獻案例結果
?in vivo siRNA和對照siRNA稀釋于水中，以20 mg/kg的劑量，每3天注射1次，連續給藥7周，將膽固醇修飾的動物用CamK-A siRNA注射到荷瘤小鼠中，檢測腫瘤大小，發現使用in vivo siRNA敲降CamK-A可顯著降低腫瘤生長，巨噬細胞募集以及血管生成。
Sang L, et al. Molecular cell, 2018.
?
銳博生物in vivo siRNA 局部注射給藥有效抑制腫瘤生長，分別注射PBS 和siRNA。
A：PBS 對照； B：in vivo siRNA? 三天給藥一次
通過瘤內注射的方式將膽固醇修飾的IFIT3 siRNA注射到SMMC-LTNM小鼠中，并用IFN-α治療，測定腫瘤大小和血清AFP，發現IFIT3 siRNA處理減弱了IFN-α在肝癌中的抗腫瘤作用。
Yang Y, et al. Hepatology, 2017.
?
??通過瘤內注射，將膽固醇修飾的動物用circMTO1 siRNA注射到HCC荷瘤裸鼠SMMC-LTNM中，測定腫瘤大小和血清AFP，發現腫瘤的生長明顯加快，血清AFP明顯增加。
Han D, et al. Hepatology, 2017.
代表性客戶文章
- Guo Q, Dong Y, Zhang Y, et al. Sequential Release of Pooled siRNAs and Paclitaxel by Aptamer-Functionalized Shell–Core Nanoparticles to Overcome Paclitaxel Resistance of Prostate Cancer[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2021.
- Wang J, Wang Y, Zhang H, et al. Identification of a novel microRNA-141-3p/Forkhead box C1/β-catenin axis associated with rheumatoid arthritis synovial fibroblast function in vivo and in vitro[J]. Theranostics, 2020, 10(12): 5412.
- Zhang S B, Lin S Y, Liu M, et al. CircAnks1a in the spinal cord regulates hypersensitivity in a rodent model of neuropathic pain[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-16.
- Wang M, Guo Y, Xue Y, et al. Engineering multifunctional bioactive citric acid-based nanovectors for intrinsical targeted tumor imaging and specific siRNA gene delivery in vitro/in vivo[J]. Biomaterials, 2019, 199: 10-21.
- Cai X, Zhu H, Zhang Y, et al. Highly efficient and safe delivery of VEGF siRNA by bioreducible fluorinated peptide dendrimers for cancer therapy[J]. ACS applied materials & interfaces, 2017, 9(11): 9402-9415.
- Huang Y, Hong J, Zheng S, et al. Elimination pathways of systemically delivered siRNA[J]. Molecular Therapy, 2011, 19(2): 381-385.
