反義寡核苷酸（ASOs）是一種短的、化學合成的單鏈寡核苷酸，通過對其骨架和糖基進行修飾，可增加其穩定性、藥理特性以及與靶標的結合，并通常具有較小的毒性。常用于細胞和動物體內基因功能研究以及ASO核酸藥物的開發等。
經過化學修飾的ASOs可以通過多種作用機制發揮作用。例如，常見的是可以通過堿基互補配對與靶標mRNA結合，導致核酸內切酶介導的轉錄本敲低，從而降低有害蛋白的水平；也可以通過空間阻斷剪接因子來改變pre-mRNA剪接；或者通過阻止核糖體募集來阻斷mRNA翻譯。此外，將ASO設計成可以與疾病發病機制相關的非編碼RNAs或毒性RNAs結合的反義分子，能夠大大擴展可選擇靶標的數量和類型。
根據其化學性質、結合序列和靶標，單鏈ASOs可以通過以下幾種不同的作用機制（Rinaldi C and Wood M J A, 2018.）調節基因表達或改變pre-mRNA剪接。
? ? ? 1. 降解靶標
? ? ? 反義寡核苷酸（ASOs）一旦與RNA結合，就會形成RNA-DNA雜合體，成為RNase H的底物，從而導致靶標mRNA的降解。研究表明，ASO的活性與RNase H水平有關，且RNase H依賴的ASO活性在細胞核和細胞質中均存在?？紤]到細胞核中RNase H的水平較高，因此，核內靶標mRNAs的降解率要高于胞質（Vickers and Crooke, 2015）。
2. 抑制翻譯
靶向AUG起始位點的ASOs可以在空間上阻斷RNA結合蛋白復合物（如核糖體亞基）的結合，從而抑制靶標mRNA的翻譯。
? ? ? 3. 抑制RNA結合蛋白
? ? ? 在由毒性RNA功能獲得機制引起的疾病中，ASOs被設計成與非編碼區的高親和力互補結合，可以通過空間位阻阻止RNA結合蛋白的結合和隔離。
4. 剪接調控
ASO結合到內含子-外顯子連接點可破壞剪接位點的穩定性，或置換或募集剪接因子，從而導致靶標外顯子的跳讀或內含。
5. 增加翻譯活性
上游開放閱讀框（uORFs）的翻譯通常會抑制主開放閱讀框（pORF）的表達。ASOs與uORFs結合能夠增加下游ORF翻譯的蛋白量。
銳博生物采用國際一流的寡核酸合成和修飾技術，可針對lncRNA/circRNA/mRNA不同序列設計高特異性ASO序列，所合成的ASO序列是經過特殊化學修飾的單鏈RNA&DNA雜合體，極大地提高了其在細胞及動物體內的穩定性，可同時干擾胞質和核內的靶標RNA，亦可用于體內實驗。并且相對病毒載體，合成周期短，適于后續ASO核酸藥的研發。
銳博生物ASO產品已被廣大客戶所認可與使用，相關研究成果也已發表在諸如Cell Research、Nature structural & molecular biology、Molecular Cancer、Nature Metabolism、PNAS等國際知名期刊。研究模型涵蓋腫瘤發生、骨生成、乳腺癌轉移、成肌分化和肌肉再生、circRNA/lncRNA轉錄調控、肝細胞癌、上皮性卵巢癌、卵巢癌化學耐藥等。
今天，小編給大家分享一篇復旦大學腫瘤研究所吳炅課題組&黃勝林課題組近期在Molecular Cancer (IF10.679)期刊上發表的題為LINC02273 drives breast cancer metastasis by epigenetically increasing AGR2 transcription的研究論文，該研究揭示了lncRNA通過表觀遺傳增加AGR2轉錄來驅動乳腺癌轉移的分子機制。而使用動物用ASO 靶向LINC02273能夠顯著抑制體內乳腺癌的轉移，這對于開發ASO核酸藥物用于治療轉移性乳腺癌具有重要的指導意義。（該研究使用到的細胞/動物用ASO由銳博生物提供）
首先，研究人員對乳腺癌患者的轉移性淋巴結和原發性腫瘤進行轉錄組分析，鑒定了一個新的lncRNA LINC02273在淋巴結轉移病灶中過表達，其位于人類染色體4q31.3內。RACE實驗發現LINC02273有兩個主要轉錄本，長度分別為1653-nt和1252-nt，這兩個轉錄本具有共同的轉錄起始站點，但是1653-nt轉錄本的表達水平顯著高于1252-nt。因此接下來的機制研究中，研究人員重點關注了LINC02273的1653-nt轉錄本。RNA-ISH和亞細胞分離實驗顯示LINC02273主要位于細胞核。
隨后，對乳腺癌淋巴結轉移臨床樣本進行了qRT-PCR檢測，發現LINC02273在淋巴結轉移灶和晚期轉移癌患者的腫瘤中高表達。Kaplan–Meier生存分析顯示高表達LINC02273與較差的無復發生存率(RFS)相關。
接下來，通過CRISPR-cas9將LINC02273敲除，結果顯示LINC02273的缺失顯著降低了乳腺癌細胞的遷移和侵襲，而過表達LINC02273則進一步增強了乳腺癌細胞的遷移和侵襲。此外，體內敲除LINC02273時，移植瘤的生長速度被顯著抑制，腫瘤體積顯著減小，肺轉移明顯減少。表明LINC02273在體內外均可促進乳腺癌的轉移。
那么，LINC02273是如何促進乳腺癌轉移的呢？RNA pull-down、免疫印跡、RIP實驗顯示LINC02273在乳腺癌細胞中與hnRNPL特異性相互作用。并且發現LINC02273的S3-2區域內的CA重復序列和hnRNPL的RRM1/2基序對于LINC02273和hnRNPL的相互作用是必需的。此外，當用放線菌素D阻斷RNA轉錄時，hnRNPL的缺失使得LINC02273的半衰期明顯縮短，且穩定性明顯降低。表明hnRNPL結合到其S3-2區域內的CA-重復序列，可以提高LINC02273的穩定性。
研究發現hnRNPL在轉移性淋巴結中的水平升高，敲低或過表達hnRNPL可抑制或增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲，揭示hnRNPL在乳腺癌中具有促轉移作用?？紤]到hnRNPL對LINC02273穩定性的影響，研究人員推測hnRNPL可能通過穩定LINC02273來發揮其病理作用。進一步的實驗結果證實了這一猜想，說明LINC02273在介導hnRNPL的促轉移中具有重要作用。
接著，研究人員對LINC02273促進乳腺癌轉移的分子機制進行了探索。通過RNA-seq、ChIRP-seq以及qPCR鑒定了182個LINC02273潛在的直接下游靶標，這些基因與癌癥的發生和轉移密切相關。有趣的是，研究人員發現LINC02273與AGR2和GUCY2C的啟動子區域結合，這表明LINC02273對這些基因的轉錄具有潛在的調控作用。測序分析顯示AGR2在LINC02273缺失細胞中的水平明顯降低，且LIN02273結合于AGR2轉錄起始位點(TSS)上游1756-2150 bp。進一步的ChIP-seq發現LINC02273的敲除會導致轉錄激活組蛋白H3K27ac和H3K4me3的降低。表明LINC02273結合AGR2啟動子區，至少部分通過增強染色質H3K4me3和H3K27ac修飾來促進AGR2的轉錄激活。
由于hnRNPL可以穩定LINC02273，那么hnRNPL是否通過LINC02273來調節AGR2？結果發現hnRNPL的下調顯著降低了AGR2的表達，支持了AGR2受hnRNPL調控的觀點。隨后，在LINC02273敲除細胞中過表達LINC02273可恢復AGR2表達的下降，而過表達hnRNPL則不能。此外，LINC02273過表達后，即使在hnRNPL表達降低的細胞中，AGR2的轉錄也升高。然而，LINC02273可能需要hnRNPL來充分激活AGR2轉錄。表明hnRNPL和LINC02273協同上調乳腺癌細胞中AGR2的轉錄。
進一步實驗發現過表達/敲低hnRNPL顯著增加/降低了AGR2啟動子區H3K4me3和H3K27ac修飾，但在LINC02273敲除細胞中hnRNPL不能增加H3K4me3或H3K27ac的修飾，說明hnRNPL對AGR2啟動子的表觀遺傳調控依賴于LINC02273。有趣的是，在hnRNPL缺失的細胞中也沒有觀察到LINC02273過表達導致的H3K4me3和H3K27ac水平的升高。表明LINC02273和hnRNPL可以協同上調AGR2啟動子區H3K27ac和H3K4me3水平，從而增強AGR2的表達，導致乳腺癌轉移增加。
緊接著，研究人員對606例侵襲性乳腺癌患者的原始樣本中hnRNPL、LINC02273和AGR2的表達水平進行檢測發現LINC02273與AGR2和hnRNPL呈正相關。同時，hnRNPL與AGR2也呈正相關。此外，AGR2的高表達與RFS較差有關。LINC02273和AGR2低表達患者的生存獲益(RFS)更為顯著。上述結果有力地支持了LINC02273高表達與乳腺癌中較差的RFS相關，并且在hnRNPL-LINC02273軸下游AGR2表達的增加可能促進乳腺癌轉移。
最后，由于反義寡核苷酸（ASO）藥物可靶向多種RNAs而受到越來越多的關注，并在體內外得到了驗證。因此，研究人員針對LINC02273設計了3個ASOs，以探討LINC02273是否可能被ASO干擾。體外實驗顯示LINC02273 mRNA的表達可被ASO顯著抑制，乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力也受到損害。體內實驗通過尾靜脈注射將10nmol ASO注射進NOD/SCID小鼠體內，每周2次。結果顯示腫瘤生長明顯下降、肺轉移灶明顯減少、腫瘤組織中LINC02273和AGR2 mRNA的表達水平降低。表明以ASO靶向LINC02273可能是一種減輕乳腺癌轉移的有效治療方法。
