CRISPR-Cas9是一種在gRNA或crRNA+tracrRNA存在的條件下通過Cas9蛋白實現對基因組定點編輯的技術，Cas9和gRNA或crRNA+tracrRNA可通過多種方式導入細胞，其在胞內的高效表達直接影響CRISPR-Cas9系統的編輯效率。通常情況下以慢病毒感染或質粒轉染等方式提供Cas9和gRNA。然而，這容易導致外源基因片段的不可控插入，并引起免疫反應，存在潛在的威脅，這在一定程度上限制了CRISPR-Cas9技術在機體的應用[1]。
近年發展起來的Cas9 RNP體系由于快捷安全、可避免質粒整合的問題、并減少脫靶效應，可適用于各種模式生物和細胞類型，如難轉染的干細胞[2]、免疫細胞[3]、原代細胞[4]等，引起了科學家們的廣泛關注。簡單來說，RNP體系只需將Cas9蛋白和體外轉錄的gRNA或直接化學合成的crRNA+tracrRNA進行孵育，二者通過靜電相互作用以及結構嵌合性，在體外組裝形成RNP復合物，然后通過轉導方式將其導入待編輯細胞即可實現非同源性末端重組（NHEJ），在供體DNA存在的條件下還可以實現特定基因的修復和插入[1]。
圖1. Cas9 RNP的組裝及其作用機制（以gRNA為例）[1]
Cas9 RNP體系編輯效率的優勢
? 不同于質粒轉染或病毒感染方式，會導致Cas9蛋白在細胞內持續表達。RNP復合物轉導入細胞后，Cas9蛋白在一定時間內即會降解，在一定程度上可以降低脫靶效應[7]；
? 操作簡便快捷，在體外將Cas9蛋白和gRNA或crRNA+tracrRNA混合，轉導后即可進行基因編輯，并且由于不需要轉錄、翻譯的過程，RNP體系可以實現即時快速的基因編輯。
| 表1. CRISPR-Cas9不同形式下基因編輯的比較[1] | ||||
| 項目 | 質粒/病毒 | 全RNA體系 | RNP體系 | 參考文獻 |
| 編輯效率 | ++ | ++ | +++ | [8] |
| 插入突變 | +++ | – | – | [9] |
| 免疫性 | +++ | ++ | + | [5] |
| 脫靶率 | +++ | ++ | + | [7] |
| 組分胞內表達時間 | ＞12h | ＞2h | – | [7] |
| 組分穩定性 | +++ | + | ++ | [6,10] |
riboEDIT CRISPR-Cas9 RNP體系
銳博生物riboEDIT? CRISPR-Cas9 RNP（核糖核蛋白復合物）由化學合成的crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白組成，其中tracrRNA可實現大規模合成，靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成，Cas9蛋白為熱穩定S.pyogenes來源的核酸酶（又稱為spCas9），僅需將crRNA和tracrRNA與Cas9蛋白混合后轉染細胞，即可快速實現靶基因的編輯。與傳統Cas9/gRNA質粒轉染相比，基因編輯效率更高，脫靶效應更低，且無DNA整合的風險，是更加理想的基因編輯系統。
圖2. 銳博生物RNP體系工作示意圖
RNP體系特點：
? 自主專利技術，優化的gRNA（crRNA與tracrRNA）和Cas9 mRNA
? 瞬時表達，有效降低脫靶率
? 無DNA組分，不整合任何病毒或質?；?/p>
? 編輯效率更高，適用于哺乳動物細胞
? 毒性更低，激活先天免疫反應更小，減少細胞死亡
? 即用型（Ready-to-Use），更加易用，適合從小規模實驗到大規模高通量篩選
? 兼容多種導入模式：化學轉染（mRNA轉染）、電轉或電穿孔、顯微注射等
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crRNA設計合成：靶向目的DNA序列
riboEDIT Designed crRNA采用優化的生物信息學設計，包含20個與目標DNA序列互補配對的核苷酸（原間隔序列）和與tracrRNA互補配對的重復序列，涵蓋人類和小鼠基因（其他物種需評估），每個基因設計合成3-6段單獨的sgRNA，經過嚴格的PAGE純化。
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通用型tracrRNA：與crRNA形成gRNA
riboEDIT tracrRNA采用化學合成通用型tracrRNA，經PAGE純化，能夠抗核酸酶，能與crRNA結合形成crRNA/tracrRNA復合物，共同指導Cas9蛋白切割雙鏈DNA。需要注意的是，riboEDIT tracrRNA與riboEDIT crRNA是專利配套體系，兩者必須配套使用（不兼容其他體系的crRNA）。
?
Cas9 mRNA：瞬時表達Cas9蛋白
riboEDIT Cas9 Protein是riboEDIT CRISPR-Cas9的RNP體系的重要組成部分，可與crRNA和tracrRNA形成RNP復合物，從而對目的DNA序列進行剪切。該即用型的RNP體系適合化學轉染（借助蛋白轉染試劑）、顯微注射或電轉（電穿孔）進行基因編輯。500pmol的Cas9蛋白相當于83ug，一般情況下每孔轉染1-2ug的Cas9蛋白，可轉染超過40次以上。
圖3. riboEDIT Cas9 RNP具有高效的基因組剪切效率
MHCC97H細胞共轉染6pmol riboEDIT? crRNA、6pmol riboEDIT? tracrRNA和6pmol riboEDIT? Cas9 Protein，48小時后 riboEDIT? T7EI Enzyme酶切檢測靶位點的剪切效率，候選7個靶基因的剪切條帶及編輯效率。如圖所示，#1#2表示同一基因不同位點設計的2條crRNA。
T7E1 Enzyme酶：檢測編輯效率
riboEDIT T7EI Enzymes是經E.coli重組表達的結構特異性酶，可識別并切割非完全配對的雙鏈DNA、十字形結構DNA、 Holliday交叉DNA、異源雙鏈DNA，或緩慢地切割帶有切刻的雙鏈DNA；可有效識別大于1個堿基的基因錯配，廣泛應用于由CRISPR-Cas9、鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶所介導的基因突變檢測。
圖4. 檢測T7EI酶切后的DNA片段
產品訂購信息
| 產品訂購信息 | |||
| 產品編號 | 產品名稱 | 目錄價 | |
| CR-NRA-1 | riboEDIT Designed crRNA（設計合成crRNA） | 詢價 | |
| crT00001-5 | riboEDIT tracrRNA, 5nmol | ￥628.00 | |
| C11053-1 | riboEDIT Cas9 Protein, S.pyogenes(20uM), 500pmol | ￥2,950.00 | |
| C11054-1 | riboEDIT T7EI Enzyme (10U/ul)，100U | ￥880.00 | |
| crRP0001VS | riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set for Human (驗證用陽性對照crRNA及正反引物) | ￥1,000.00 | |
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參考文獻：
[1] PAN H, YANG H, YU S, et al. Progress in Gene Editing Methods of CRISPR/Cas9 Based on in Vitro Assembly of Ribonucleoprotein[J].?China Biotechnology, 2019, 39(1): 71-76.
[2] Wang R, Graham S, Gao L, et al. Editing the immune system in vivo in mice using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP)-mediated gene editing of transplanted hematopoietic stem cells[J].?Methods, 2021.
[3] Schumann K, Lin S, Boyer E, et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins[J].?Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(33): 10437-10442.
[4]徐婭, 付烊, 朱詩聰,等. 利用Cas9 RNP技術制備B2M和PD-1高效率雙基因敲除的人原代T淋巴細胞[J].?腫瘤防治研究, 2020(6):403-410.
[5] Chen X, Gon?alves M A F V. Engineered viruses as genome editing devices[J].?Molecular Therapy, 2016, 24(3): 447-457.
[6] Jinek M, Jiang F, Taylor D W, et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation[J].?Science, 2014, 343(6176).
[7] Burger A, Lindsay H, Felker A, et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes[J].?Development, 2016, 143(11): 2025-2037.
[8] Wang H X, Li M, Lee C M, et al. CRISPR/Cas9-based genome editing for disease modeling and therapy: challenges and opportunities for nonviral delivery[J].?Chemical reviews, 2017, 117(15): 9874-9906.
[9] Woo J W, Kim J, Kwon S I, et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins[J].?Nature biotechnology, 2015, 33(11): 1162-1164.
[10] Kim S, Kim D, Cho S W, et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins[J].?Genome research, 2014, 24(6): 1012-1019.
