Nature子刊丨銳博circRNA測序/動物用miRNA產品助力CircAnks1a調控神經性疼痛新機制發現

許多信號級聯和分子（如神經炎癥反應、嘌呤受體、內源性阿片肽和神經營養因子）參與神經性疼痛的發展。然而，神經性疼痛的分子機制尚不清楚。環狀RNAs（circRNAs）是內源性非編碼RNA，形成共價閉環；它們的序列在物種間是保守的，比線性mRNAs具有更高的穩定性。大多數circRNAs在哺乳動物大腦中的表達豐度高于其他組織，這表明它們可能在病理過程中發揮重要作用，并可能作為某些神經系統疾病的生物標志物。CircRNAs已被證明可作為競爭性內源RNAs，通過堿基互補配對使miRNAs結合并調節靶mRNAs的翻譯。此外，有證據表明某些circRNAs可與RNA結合蛋白形成RNA-蛋白復合物并調節其活性。雖然最近的研究表明，神經損傷改變了大鼠脊髓背角circRNA的表達，但circRNA是否以及如何引起神經性疼痛尚未見報道。

2019年9月11日，中山大學中山醫學院信文君課題組在Nature Communications期刊上發表了題為CircAnks1a in the spinal cord regulates hypersensitivity in a rodent model of neuropathic pain最新成果。首次發現脊髓特異性環狀RNA circAnks1a促進轉錄因子YBX1的核轉位，揭示了circAnks1a在轉錄水平和轉錄后水平調控背角神經元VEGFB表達，并參與神經損傷引起的中樞敏化和疼痛行為的分子機制，為開發有效治療神經損傷引起的神經性疼痛提供了新的靶點。

1、脊髓背角circAnks1a的篩選與鑒定

首先，研究人員收集了脊神經結扎（SNL）前后大鼠的脊髓背角組織并通過RNA-seq（由銳博生物提供）檢測其circRNA的表達。發現65.02％的circRNAs由編碼蛋白質的外顯子組成，并且發現SNL處理后有21個circRNAs顯著失調。通過qPCR分析發現circAnks1a表達在SNL處理后表現出最顯著的增加。

2、增加circAnks1a可介導疼痛樣超敏反應

為了驗證circAnks1a與慢性疼痛有關，研究人員通過鞘內注射的方式將circAnks1a siRNA注射到SNL處理的大鼠體內。電生理和疼痛行為分析發現敲低CircAnks1a可顯著改善SNL誘導的mEPSCs振幅和頻率的增加，并可減弱SNL誘導的機械性異常性疼痛。過表達CircAnks1a則產生相反的結果。表明脊髓特異性和保守性circAnks1a有助于中樞致敏和行為超敏反應，可能是治療慢性疼痛的新靶點。

3、VEGFB促進神經元興奮和神經性疼痛

為了闡明circAnks1a調控神經性疼痛的分子機制，研究人員將circAnks1a的AAV過表達載體注射到大鼠體內，并通過全基因組表達譜芯片分析脊髓背角基因表達的變化。結果發現有29個轉錄本表達上調，其中VEGFB mRNA的表達表現出最大的增加，并且VEGFB mRNA和蛋白水平在SNL模型中也是顯著增加。此外，VEGFB僅在神經元（NeuN）中表達，而在脊髓背角星形膠質細胞（GFAP）或小膠質細胞（Iba-1）中不表達。通過鞘內注射VEGFB siRNA可顯著改善mEPSC振幅和頻率的增加，并減輕了SNL誘導的機械性異位性疼痛。過表達VEGFB則產生相反的結果。表明VEGFB在神經損傷引起的神經性疼痛的發生過程中起著重要的作用。

4、CircAnks1a調節VEGFB在神經病理性疼痛中的上調

研究人員進一步研究了在SNL誘導的慢性疼痛中，VEGFB的上調是否由circAnks1a介導。結果顯示circAnks1a與VEGFB共定位，鞘內注射circAnks1a siRNA可減少SNL后脊髓背角中VEGFB mRNA和蛋白的上調。過表達circAnks1a則顯著增加VEGFB mRNA和蛋白質水平。表明SNL處理后脊髓背角中VEGFB的上調依賴于circAnks1a的表達。

5、CircAnks1a促進YBX1的核轉位

為了闡明circAnks1a調節VEGFB表達的分子機制，研究人員通過RNA pulldown、RIP等實驗證實了circAnks1a與YBX1蛋白之間存在明顯的相互作用，并且在細胞質和細胞核中均有結合。此外，還發現SNL處理后，細胞核YBX1的數量顯著增加，且這一增長與circAnks1a的增長呈現出類似的時間過程。那么circAnks1a是否參與了YBX1的核轉位呢？結果發現敲低circAnks1a抑制了核YBX1的積累，過表達circAnks1a則顯著增加了核YBX1的水平。進一步的實驗發現transportin-1能夠與YBX1相互作用，并介導YBX1的入核。而鞘內注射circAnks1a siRNA可顯著減弱這種相互作用。表明circAnks1a通過直接與YBX1相互作用，增強了YBX1與transportin-1的相互作用，從而促進了神經損傷后YBX1在背角的核轉位。

6、YBX1促進VEGFB上調

為了探索核YBX1介導VEGFB上調的機制，研究人員首先預測了Vegfb基因啟動子區域中YBX1的潛在結合位點。ChIP-PCR分析顯示SNL處理后YBX1向Vegfb啟動子的募集顯著增加。隨后的熒光素酶報告基因實驗也證實了YBX1與Vegfb啟動子的結合是功能性的，過表達YBX1可增強熒光素酶活性。

進一步的實驗發現：抑制circAnks1a的表達顯著降低了YBX1的富集，過表達circAnks1a則增加了YbX1在Vegfb啟動子上的富集。熒光素酶分析也顯示過表達circAnks1a可增強YBX1與Vegfb啟動子的結合，表明circAnks1a可能直接促進YBX1向Vegfb啟動子的募集。接下來的ChIRP和熒光素酶分析顯示circAnks1a是與Vegfb啟動子的-1834到-1687（promoter region 1）位置強烈結合。表明細胞核外顯子circAnks1a直接與Vegfb基因結合，并通過募集YBX1到Vegfb啟動子來促進Vegfb的轉錄。

8、CircAnks1a通過miR-324-3p調控VEGFB的表達

研究人員通過RIP和qPCR分析發現circAnks1a可能具有吸附miRNA的能力。隨后，通過miRanda預測、熒光素酶報告基因實驗、RNA pull-down等確定了miR-324-3p，并且FISH實驗發現miR-324-3p在神經元中表達，與circAnks1a共定位。表明circAnks1a作為miR-324-3p的海綿。

接下來，研究人員還發現miR-324-3p與VEGFB共定位，并且miR-324-3p可與VEGFB mRNA的3’UTR結合。體內實驗顯示鞘內注射miR-324-3p agomir（由銳博生物提供）可顯著降低VEGFB蛋白的增加，但不影響VEGFB mRNA水平，此外還可顯著增加機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。鞘內注射miR-324-3p antagomir（由銳博生物提供）則產生相反的結果，表明CircAnks1a是通過miR-324-3p調控VEGFB的表達。

原文：Zhang S B, Lin S Y, Liu M, et al. CircAnks1a in the spinal cord regulates hypersensitivity in a rodent model of neuropathic pain[J].?Nature communications, 2019, 10(1): 1-16.