干貨丨你想要的高內涵神經細胞研究策略都在這里
神經疾病（Nerve Disease）是由多種病因引起，發生于中樞神經系統、周圍神經系統、植物神經系統的以感覺、運動、意識、植物神經功能障礙為主要表現的疾病，嚴重影響人類的健康。神經疾病的研究領域包括神經系統變性病、腦血管病、運動障礙病、中樞神經系統脫髓鞘病、癲癇、遺傳代謝病、神經肌肉病、感染、腫瘤等，主要涉及神經疾病的病因、發病機制、病理、臨床表現、診斷標志物研究、藥物靶標篩選與治療。隨著對神經疾病發病機制的深入研究，發現基于核酸或基因治療的策略可能是攻克眾多神經疾病的一種有效途徑。
神經細胞分化研究對于從事阿爾茨海默氏癥、帕金森病、中樞神經系統損傷以及中風/腦卒中等疾病的或藥物發現的科學家來說非常重要，銳博生物可提供基于非編碼RNA（lncRNA、miRNA等）的神經系統疾病及行為的研究方案，包括差異表達篩選、表達驗證、細胞功能研究、機制研究、動物實驗等系列產品與服務。今天，小編要跟大家分享銳博生物最新的IN Cell Analyzer激光共聚焦高內涵平臺應用于神經突觸生長檢測和化學誘導神經毒性研究的策略。
IN Cell Analyzer高內涵細胞功能研究的技術策略
怎樣從獲得更豐富的神經細胞細胞影像并從中尋找神經細胞分化的信號？如何獲得更多意想不到的驚喜發現？借助具有更強的圖形獲取/分析功能的激光共聚焦高內涵平臺，是神經細胞分化和毒性研究及篩選的不二選擇。
高內涵用于化學或藥物誘導神經細胞表型分析
實驗首先使用熒光檢測成像模式對96孔樣品板中經神經毒素（藥物）處理的大鼠PC12細胞和原代海馬神經元進行分析檢測，分析之前對神經元和星形膠質細胞進行共培養并標記細胞神經突起生長和突觸活動。下面這張圖片大鼠PC12細胞采用IN Cell大型CCD使用10x物鏡（0.45NA）成像。
圖1. 顯示用DAPI（藍色）、FITC-βIII-微管蛋白（綠色）和Cy3-突觸素（紅色）標記的細胞通過“無縫拼接功能”融合3色覆蓋圖，圖像顯示完整的FOV。
培養染色條件：將細胞以2000個細胞/孔接種在含有生長培養基的96孔板中，24 h后，用含有100ng / mL NGF的低血清培養基替換生長培養基，將細胞再培養6天，每3天更換培養基/ NGF，固定樣品并在推薦條件下染色。
該高內涵平臺可在更少視野下進行全孔圖像快速采集，通過調整物鏡分辨率實現神經突起生長最佳觀察效果，在培養24 h后加入不同濃度的諾考達唑，觀察原代大鼠海馬神經元對神經毒素的反應，并分析擴展到使用C3-突觸素標記來監測突觸形成。A/C/E 用1nM諾考達唑處理，B/D/F用10μM諾考達唑處理。
圖2. 使用4x和10x物鏡對大鼠PC12細胞成像，（A和B顯示用DAPI（藍色）和FITC-βIII微管蛋白（綠色）標記的細胞融合的2色覆蓋圖，以4x（0.2NA）獲得4個視野，并使用IN Cell“無縫拼接功能”合成圖像。C和D分別顯示來自A和B的4x圖像的數字變焦，E和F顯示10x圖像的數字變焦（Cy3-突觸素也以紅色顯示）。
圖3. 使用10x物鏡（0.45NA）大鼠海馬神經元高內涵圖像，通過“無縫拼接”功能顯示了用DAPI（藍色），FITC-βIII-微管蛋白（綠色）和Cy3-突觸素（紅色）標記
培養與染色條件：細胞以每孔10,000個細胞接種到含有生長培養基的96孔板內，細胞共培養11天，然后在推薦條件下進行固定和染色。
圖4. 使用10x物鏡大鼠海馬神經元高內涵圖像。
A中的圖像是來自完整FOV 10x圖像，B突出顯示部分的數字變焦。C中的圖像顯示了細胞體（深藍色）、神經元（淺藍色）和突觸（黃色）在圖像分析中的疊加。
圖5 高內涵檢測大鼠海馬神經元對丙烯酰胺的劑量反應
圖像顯示用0.1mM（A）和1mM（B）丙烯酰胺處理的細胞（顯示10x的部分FOV）。報告每個細胞的平均神經突長度和每個細胞的突觸數（C），并與每孔4個視野的總細胞計數（D）進行比較，顯示的所有數據代表3個孔的平均值（+/- SEM）。
高內涵監測活細胞神經突起生長
該高內涵平臺擁有活細胞控制模塊，可精確控制細胞培養的溫度、濕度、CO2和O2濃度，滿足活細胞長時間觀察和低氧環境培養的要求，運用此模塊捕獲活小鼠神經-2a細胞暴露于視黃酸細胞影像，可獲得培養過程中不同模式下超過4天以上的圖像，允許在獲取圖像時間間隔中將培養板保持在儀器中，可見高內涵是一種理想的分析監測活細胞分化的手段。
圖6. 高內涵鑒定明視野中以10x成像的Neuro-2a細胞
培養和觀察條件：將小鼠Neuro-2A神經母細胞瘤細胞以每孔2000個細胞接種于96孔板中，在Eagle’s MEM / 10％FBS中孵育過夜。以5μM的終濃度加入視黃酸，在低血清培養基（2％）中繼續培養4天，使用明視場和相差模式以10x定期成像，添加復合物后將會顯示各個時間點的部分FOV明視場圖像。
圖7. 高內涵成像觀察Neuro-2a細胞分化時間過程
A中數據展示了IN Cell平臺數據的Spotfire散點圖，神經突長度（Y軸）與添加視黃酸至5μM后的時間（小時，X軸），均來自相同的圖像區域。B中圖像顯示完整FOV 10x明視場圖像，細胞（紅色）和神經突（綠色）圖像進行了疊加。
高內涵平臺全面助力神經學研究
銳博生物IN Cell Analyzer 6500HS除了實現上述的高內涵成像分析之外，還具有一系列卓越的功能，如 3D 結構成像、低豐度內源生物分子成像還是蛋白共定位以及高通量檢測。當我們完成神經細胞培養、轉染或藥物處理之后，再通過銳博生物激光共聚焦高內涵平臺進行神經突起生長觀察、全孔圖像捕獲和分析、亞細胞結構分析（突觸分析）以及神經元細胞分化無標記活細胞研究，同時“雙平臺”篩選策略以最大程度提高研究工作效率。
銳博生物高內涵“雙平臺”科研服務策略
小貼士
小編知道對于從事神經細胞研究的小伙伴們而言，原代神經細胞的分離、培養和轉染充滿著挑戰，轉染試劑在轉染質粒時對原代神經元細胞毒性都很大，一般需要從專業的供應商處購買原代細胞，嚴格地選擇分離或轉染試劑，盡量減少對神經細胞的毒性影響，通過多開展一些預實驗條件找到最佳的實驗條件。
進一步了解激光共聚焦高內涵成像與篩選服務
激光共聚焦高內涵成像與分析篩選服務(HCA&HCS)利用優秀的成像技術及強大的圖像處理技術，從細胞或細胞群體中提取信號數據，進行包含細胞及亞細胞形態結構信息等的多參數量化分析，結合高速成像甚至自動化的成像檢測，建立標準化的分析流程分析參數，可實現快速高通量篩選的工作。基于高內涵篩選本身的特性，幾乎所有基于熒光成像檢測和分析的技術都可直接在高內涵平臺上獲得更有價值的發現，銳博生物IN Cell激光共聚焦高內涵平臺可提供完美細胞影像與精準定量信息，誕生更高價值的數據影像結果。
相比傳統的生物學功能研究手段，可實現：
1、更深入理解復雜的細胞學機理和相互作用
2、非破壞性活細胞功能的多標記/多靶點/多參數分析與篩選
3、高通量快速大規模細胞學分析，從單個細胞至細胞群組
4、實驗時間從幾天縮短至幾個小時或幾分鐘
5、提出更多細胞學問題，產生更多原創新研究成果
（以上部分內容來自GE醫療IN Cell Poster: Robert Graves. Analysis of neurite outgrowth assays using IN Cell Analyzer）
