膽汁酸反流和隨后的CDX2（尾型同源框轉錄因子2）激活有助于胃腸上皮化生（IM），這是胃癌的前兆；然而，這種現象背后的機制尚不清楚。近日，Molecular Therapy – Nucleic Acids在線發表了題為Essential role of ALKBH5-mediated RNA demethylation modification in bile acid-induced gastric intestinal metaplasia的研究論文。報道了ALKBH5和NF-κB信號之間的m6A修飾相關正前饋回路參與了胃上皮細胞IM表型的產生。暗示了靶向ALKBH5/ZNF333/CYLD/CDX2軸可能是治療膽汁反流患者胃IM的有效策略。
主要研究結果
??膽汁酸誘導胃細胞中的腸道標志物表達
前期試驗發現膽汁酸刺激結束后可觀察到關鍵IM標志物CDX2的峰值水平。為了探索膽汁酸對胃IM過程的可能影響，研究人員首先用三種類型膽汁酸，即膽酸（CA）、脫氧膽酸（DCA）和鵝去氧膽酸（CDCA）對胃上皮細胞系GES-1進行處理。然后通過qRT-PCR檢測腸道標記物CDX2、VIL1和KLF4的表達以確定IM表型。結果發現所有三種類型的膽汁酸，尤其是CDCA，都以時間和劑量依賴性方式誘導腸道標志物的表達。共聚焦免疫熒光顯微鏡進一步證實了這些結果。表明CDCA在GES-1細胞中誘導了IM表型。
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??ALKBH5是胃IM所必需的
之前已經證明m6A修飾促進了GC的EMT過程。為了確定m6A是否在癌前病變中發揮作用，研究人員使用qRT-PCR檢測了主要m6A修飾酶在胃IM中的表達。結果發現CDCA處理后，GES-1細胞中的ALKBH5顯著上調，且ALKBH5表達與CDX2表達呈正相關。在培養的細胞系中，AGS細胞顯示出ALKBH5和CDX2的高表達。隨后的功能缺失和功能獲得性研究顯示ALKBH5過表達導致CDX2和下游腸道特異性標志物VIL1和KLF4的表達顯著增加，而ALKBH5敲低則導致相反的結果。有趣的是，ALKBH5的缺失消除了由CDCA誘導的胃IM標志物的表達。
接下來，研究人員使用免疫組化檢測了包括80個病例（Cohort 1）胃IM組織微陣列樣品中的ALKBH5水平。發現在大多數胃IM標本中，ALKBH5免疫反應性主要呈陽性。為了進一步驗證這些結果，在另外48對石蠟包埋的胃IM組織（Cohort 2）中檢測了ALKBH5的表達，并證實與相鄰正常胃組織相比，ALKBH5在IM組織中顯著過表達。表明ALKBH5促進了膽汁酸誘導的胃IM。
??ZNF333是ALKBH5在膽汁酸誘導的胃IM中的直接靶點
為了鑒定受m6A調控的轉錄本，研究人員通過m6A測序分析了對照或CDCA處理的GES-1細胞在轉錄組水平上的m6A分布。結果顯示在對照和CDCA處理的細胞中觀察到類似的總體m6A模式，分別鑒定了63093個和52188個m6A峰，總的m6A水平無顯著差異。與在對照組（49.6%）和處理組（39.0%）中觀察到的獨特峰相反，有11.4%的峰在兩組中都發現了。此外，GGAC（RRACH）的m6A共有基序在m6A位點內高度富集。由于ALKBH5是一種RNA去甲基化酶，研究人員將重點集中在減小的m6A峰，并在CDCA處理的GES-1細胞中發現了2994個峰被減少。
接下來，研究人員通過RNA測序分析比較CDCA處理后GES-1細胞的基因表達譜。發現共有1818個轉錄本差異表達。那么，這些改變的轉錄本是否是m6A修飾的結果呢？有報道稱，ALKBH5可使靶mRNA去甲基化，導致轉錄本表達增強。因此，本研究選擇了m6A水平降低但表達升高的轉錄本。通過將2994個減小的m6A峰與644個升高的轉錄本過濾后，鑒定出24個轉錄本包含的27個峰，其中6個基因轉錄本的m6A修飾減少了9倍以上。在這些基因中，與對照相比，CDCA處理的細胞中ZNF333 mRNA（chr19：14829096-14829367）外顯子周圍檢測到m6A峰的大小急劇減小，并且ZNF333的表達在CDCA的響應下增加。有趣的是，通過抑制ALKBH5可消除ZNF333 mRNA水平。表明ZNF333可能是ALKBH5的直接靶點，并被選擇用于后續對CDCA誘導IM的研究。
??ALKBH5維持ZNF333在胃IM中的表達
為了進一步研究ALKBH5對ZNF333表達的調控作用，研究人員進行了qRT-PCR和western blotting分析。發現ALKBH5異位表達增加了ZNF333在mRNA和蛋白質水平上的表達。相反，ALKBH5敲低則降低了ZNF333的表達。免疫熒光分析顯示ALKBH5和ZNF333在細胞中的核共定位，其中ALKBH5的過表達上調了ZNF333水平，而ALKBH5的缺失則介導了ZNF333的缺失。此外，免疫組化分析顯示，與ALKBH5共表達的ZNF333水平在胃IM組織中經常升高。這些數據表明ALKBH5在胃IM中正調節ZNF333的表達。
??ALKBH5通過消除m6A-YTHDF2依賴性mRNA降解來增加ZNF333的表達
為了揭示ALKBH5對ZNF333表達的m6A相關調控機制，研究人員對m6A測序數據進行了MeRIP qRT-PCR驗證。發現m6A特異性抗體在ALKBH5過表達時顯著降低了ZNF333 mRNA的富集，而在ALKBH5敲低時顯著增加了ZNF333 mRNA水平的富集。此外，研究人員發現催化失活突變型ALKBH5過表達不能在mRNA和蛋白質水平上調節ZNF333的表達。當引入全局甲基化抑制劑DAA（3-脫氮腺苷）時，觀察到ZNF333 mRNA的表達增加。表明ALKBH5主要通過其去甲基化活性調節ZNF333的表達。
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m6A在調節RNA表達中的作用主要由reader蛋白執行。最近的研究表明YTHDF2調控ALKBH5的靶點。正如預期的那樣，m6A測序發現YTHDF2結合位點與ZNF333的m6A修飾區非常接近。進一步的研究顯示過表達YTHDF2部分抵消了ALKBH5水平升高對ZNF333表達的影響。相反，敲低ALKBH5降低了ZNF333的表達，并且YTHDF2的抑制逆轉了這種降低。此外，敲低ALKBH5削弱了ZNF333 mRNA的穩定性，而YTHDF2的敲低增強了sh-ALKBH5細胞中ZNF333 mRNA的穩定性。表明YTHDF2介導的RNA衰變控制了ZNF333的表達。即ALKBH5通過消除m6A-YTHDF2依賴的mRNA降解來增加ZNF333的表達。
??ALKBH5通過ZNF333-NF-κB通路調節胃IM
為了更好地了解ALKBH5/ZNF333軸在胃IM中的潛在調控作用，研究人員進行了RNA測序以分析受ZNF333過表達影響的基因表達譜，發現與對照相比，處理組細胞中有460個失調基因。KEGG通路分析表明，NF-κB、p53、VEGF和MAPK通路在ZNF333過表達細胞中顯著富集，并且NF-κB信號被ZNF333顯著激活。進一步的研究顯示，沉默ALKBH5降低了ZNF333的表達和p65的磷酸化，而NF-κB信號特異性抑制劑Bay對p65磷酸化的抑制降低了ALKBH5誘導的胃IM標志物的表達。此外，共聚焦免疫熒光檢測證實了ALKBH5在促進p65向核定位重新分布中的作用。
接下來，研究人員通過一系列實驗來確定ALKBH5對NF-κB信號和胃IM的影響是否與ALKBH5/ZNF333軸有關。蛋白質印跡分析顯示，ZNF333的敲低部分抵消了ALKBH5過表達引起的NF-κB信號傳導的激活和IM 表型的加速。相反，ZNF333表達的升高重現了sh-ALKBH5細胞中p65磷酸化和胃IM標志物的水平。此外，熒光素酶報告基因實驗顯示CDCA處理激活了NF-κB信號，而這被ALKBH5或ZNF333的缺失所抑制。這些結果表明膽汁酸誘導的胃IM過程涉及ALKBH5/ZNF333/NF-κB信號軸。
??ZNF333/CYLD軸激活NF-κB通路和CDX2表達
鋅指蛋白作為人類基因組中最大的轉錄因子家族，具有廣泛的轉錄激活或抑制作用。為了評估ZNF333的轉錄活性。研究人員使用Gal4驅動的熒光素酶報告系統，發現ZNF333以劑量依賴性方式顯著抑制報告活性。結果表明ZNF333與DNA物理結合以發揮其轉錄抑制功能。
隨后，研究人員通過FIMO工具和ChIP實驗證實了ZNF333直接結合CYLD啟動子區域（-952至-944 bp）。進一步的研究表明，ZNF333的異位表達導致CYLD mRNA和蛋白質水平降低，而ZNF333的敲低則增加了CYLD水平。此外，沉默CYLD或過表達ZNF333激活了NF-κB信號及其下游靶標，而CYLD的恢復顯著減弱了這種情況。表明ZNF333通過CYLD的轉錄抑制來促進經典的NF-κB信號。
接下來，研究人員發現在48個胃IM組織（Cohort 2）中，CDX2與p-p65的表達呈正相關。然后通過JASPAR對CDX2啟動子區域的生物信息學分析預測了p65的DNA結合元件。ChIP分析證實，在用CDCA處理的GES-1細胞中，該區域中p65的富集顯著增加。這些結果表明ZNF333/CYLD軸介導了CDCA刺激的胃細胞中NF-κB信號轉錄激活CDX2的上調。
??p65介導的胃IM中ALKBH5轉錄激活
越來越多的證據表明，功能性前饋回路參與了生物過程。研究發現，當使用特定信號激活劑TNF-α激活NF-κB信號時，ALKBH5表達顯著增加。而作為NF-κB信號抑制劑的Bay抑制了ALKBH5的水平。因此，研究人員推測ALKBH5和NF-κB信號之間可能存在前饋回路。為了驗證這一假設，研究人員通過熒光素酶報告基因實驗發現CDCA介導的ALKBH5調節受假定的NF-κB結合位點控制。ChIP實驗證實了p65直接與兩個區域（-673至-664bp 和 -1314至-1305bp）結合。此外，與對照相比，anti-p65抗體顯著富集了CDCA處理細胞中ALKBH5的表達。這些數據表明p65與ALKBH5啟動子結合并加速ALKBH5的轉錄，從而在膽汁酸誘導的胃IM中形成正反饋回路。
??ALKBH5/ZNF333/CDX2通路是IM組織的特征
為了評估上述信號軸的臨床相關性，研究人員使用48對胃IM組織（Cohort 2）進行進一步的免疫組化染色。結果顯示ALKBH5、ZNF333和CDX2的表達升高，與相鄰的正常粘膜相比，胃IM組織中同時存在低水平的CYLD。然后根據ALKBH5、ZNF333、CYLD和CDX2的表達將IM病例分為高組和低組。正如預期的那樣，ALKBH5表達與ZNF333和CDX2呈正相關，與CYLD表達呈負相關。最后，研究人員收集并鑒定了另外20對胃IM組織（Cohort 3）。qRT-PCR檢測顯示胃IM組織中ALKBH5、ZNF333和CDX2的mRNA水平上調，而CYLD mRNA水平顯著降低。ALKBH5轉錄水平與ZNF333和CDX2 mRNA水平共表達。相反，在mRNA水平上觀察到ALKBH5和CYLD之間的負相關。這些發現表明ALKBH5/ZNF333/CDX2通路與人胃IM有關。
總之，本研究首次闡明了人類胃IM中的m6A修飾譜。新發現的ALKBH5/ZNF333/NF-κB通路進一步完善了目前推測的CDX2調控機制，并為GC的早期檢測和預防提供了一些新的見解。暗示靶向ALKBH5和ZNF333可能是一種有效預防和治療膽汁反流患者胃IM的策略，因此在臨床轉化中具有重要價值。
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2162253121002134
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本研究中涉及的m6A-seq服務、RNA-seq服務、載體構建服務、siRNA及其NC產品均由銳博生物提供！
