摘要

本研究結果表明miR-29b促進細胞和小鼠模型中不同類型的骨骼肌萎縮。miR-29b促進C2C12或原代成肌細胞分化的肌管萎縮，相反，其抑制減弱地塞米松（Dex），TNF-α和H2O2誘導的萎縮。通過miR-29b靶向IGF-1和PI3K（p85α）可導致肌肉萎縮。在體內，miR-29b過表達會促進肌肉萎縮，而抑制miR-29b則削弱去神經化和固定化導致的萎縮。 這些數據表明，通過靶向IGF-1和PI3K（p85α），miR-29b導致多種類型的肌肉萎縮，抑制miR-29b可能是不同刺激導致的肌肉萎縮的治療方法。

研究背景

肌肉萎縮可導致功能狀態不佳，生活質量下降，發病率和死亡率增加。肌肉萎縮的治療仍然是一個未解決的挑戰。因此，迫切需要開發新的治療方法來消除骨骼肌肉的損失。類胰島素樣生長因子1-磷酸肌醇3-激酶-AKT（IGF-1-PI3K-AKT）信號傳導途徑的抑制已被證實可導致肌肉萎縮。抑制AKT會激活因子Forkhead Box O3（FOXO3）。FOXO3A導致萎縮泛素連接酶表達增加（包括肌肉特異性RING-finger 1（MURF-1）和Atrogin-1（MAFBX））。不同miRNA參與肌生成和肌肉再生；反之，miRNA也在不同的肌肉萎縮模型中發揮作用。然而，使用不同模型的肌肉萎縮來明確miRNA作用的系統性研究尚未有報道。

研究路線

1、鑒定導致肌肉萎縮的miRNA：miRNA Array、去小腿右坐骨神經的小鼠模型、qRT-PCR等
2、miR-29b體外功能研究：miRNA mimics、過表達載體、miRNA inhibitors等
3、miR-29b作用機制：TargetScan、熒光素酶報告分析、siRNA、mimics、inhibitors等
4、miR-29b體內功能驗證：miRNA agomir、HE染色、PAS與SDH染色、抗體免疫熒光染色等

注：本研究使用到的miRNA mimics/inhibitors及其NC，miRNA agomir及其NC，Bulge-Loop miRNA qPCR Primer Set 均有銳博生物提供。

研究結果

1） miR-29b在多種類型的肌萎縮中表達增加

為了鑒定在肌肉萎縮中起作用的miRNAs，作者對經歷過右坐骨神經去神經支配的大鼠腓腸肌進行了miRNA芯片測序，并用qRT-PCR驗證總共8個最大誘導量的miRNAs。其中miR-212、miR-29b、miR-21和miR-221在大鼠和小鼠去神經腓腸肌中均有增加。為了研究鑒定的miRNAs是否可以在其他肌肉萎縮模型中發揮作用，在由地塞米松（Dex）、空腹、癌癥惡病質和衰老分別引起肌肉萎縮的體內模型中分析它們的表達水平（圖1）。在這4種體內萎縮模型中，發現只有miR-29b在每個模型中的表達均增加。同時作者進行了其他一系列實驗證實了無論在體外還是在體內，miR-29b表達量在肌肉萎縮模型中都普遍上調，表明miR-29b在該過程中潛在的功能作用。

2） miR-29b在體外控制肌肉萎縮

作者通過miR-29b mimic與miR-29b過表達質粒雙實驗證明，miR-29b過表達導致肌管直徑減小，而Atrogin-1和Murf-1升高（圖2）。同時，用miR-29b inhibitor做了一系列實驗反向支持miR-29b是肌肉萎縮所必需。研究結果表明miR-29b可控制體外肌肉萎縮。

3） IGF-1和PI3K(p85α)是miR-29b的靶基因

為了研究miR-29b促進肌肉萎縮的作用機制，作者用TargetScan推測出miR-29b的潛在靶標分別是IGF-1和PI3K（p85α），它們是涉及PI3K-AKT-哺乳動物雷帕霉素（mTOR）信號傳導途徑的關鍵蛋白。在非分裂的肌肉細胞中，該途徑的激活刺激蛋白質合成并抑制蛋白質降解。在萎縮細胞中，PI3K-AKT-mTOR信號傳導減弱。

隨后的熒光素酶報告分析顯示，外源性miR-29b導致IGF-1或PI3K（p85α）的3’UTR載體轉染的細胞中熒光素酶活性降低，但是當IGF-1或PI3K（p85α）3’UTR中假定的miR-29b結合位點發生突變時沒有效果（圖3a）。這表明IGF-1和PI3K（p85α）都是miR-29b的直接靶標。

通過miR-29b mimics與inhibitors分別轉染C2C12肌管結果證明，miR-29b可以調節骨骼肌細胞中的內源性IGF-1和PI3K（p85α）表達水平（圖3b）。為了進一步評估IGF-1和PI3K（p85α）是否介導miR-29b的促萎縮效應，在miR-29b存在的情況下，使用IGF-1或PI3K（p85α）過表達質粒上調IGF-1或PI3K（p85α）。作者發現IGF-1或PI3K（p85α）過表達可以減弱miR-29b的促萎縮作用（圖3cd）。這些結果表明， IGF-1和PI3K（p85α）表達是miR-29b促進肌肉萎縮的部分原因，隨后作者做了體內實驗也得到一致的結果。

4）Yin Yang 1的下調引起miR-29b的上調

為了探索是什么引起了miR-29b的上調，作者查閱相關文獻后鎖定Yin Yang 1（YY1），決定研究YY1是否調控C2C12肌管中的miR-29b。實驗發現通過siRNA敲低Yy1增加了C2C12肌管中的miR-29b水平（圖4a）。另外，在由部分肌肉萎縮模型中，YY1的mRNA和蛋白質表達水平一直處于較低的水平。而且，在完全分化的C2C12肌管中，Yy1 siRNA降低了肌管直徑并提高了Atrogin-1和Murf-1的表達（圖4b，c），表明其在調節肌肉萎縮中的功能作用。因此，YY1的下調可能會觸發miR-29b的上調并導致肌肉萎縮。

5）miR-29b導致體內肌肉萎縮

作者還研究了miR-29b在體內對肌肉萎縮的影響，使用miR-29b agomir增加小鼠腓腸肌中miR-29b的表達水平。腓腸肌重量、腓腸肌重量/體重比、握力、肌管直徑、線粒體和糖原含量的減少證實了體內肌肉萎縮（圖5a）。注射了miR-29b agomir的小鼠中，IGF-1、PI3K（p85α）和IGF-1下游效應物在腓腸肌中的表達降低（圖5b）。并通過其他實驗佐證miR-29的增加能夠誘導體內肌肉萎縮。

為了研究抑制miR-29b是否會減弱肌肉萎縮，作者用肌內注射miR-29b海綿，然后去除右側坐骨神經。miR-29b海綿能夠降低腓腸肌中的miR-29b表達水平，導致去神經支配誘導的肌肉萎縮減少44.8％。類似地，注射miR-29b海綿的小鼠腓腸肌重量、肌纖維直徑和去神經肌肉中Atrogin-1和Murf-1表達水平也減少（圖6）。除此之外，腓腸肌中IGF-1，PI3K（p85α）和IGF-1下游效應物的表達水平增加。以上實驗表明抑制miR-29b具有抗萎縮作用并且可以延緩部分肌肉萎縮。