在前列腺癌（PCa）患者中，骨病變在射線照片中表現為成骨細胞樣；然而，PCa患者經常發生病理性骨折，并且在組織病理學評估下所有轉移性病變均可觀察到骨吸收。平衡PCa患者成骨細胞和破骨細胞活性的機制尚不清楚。近日，Journal of Extracellular Vesicles（IF25.842）期刊在線發表了題為Exosomes derived from osteogenic tumor activate osteoclast differentiation and concurrently inhibit osteogenesis by transferring COL1A1-targeting miRNA-92a-1-5p的研究論文。揭示了成骨腫瘤外泌體通過轉移靶向COL1A1的miRNA-92a-1-5p來促進破骨細胞分化并抑制成骨發生的作用機制，為PCa骨轉移提供了潛在的治療靶點。
模型示意圖：PCa外泌體通過轉移miR-92a-1-5p和靶向COL1A1來調節骨內穩態、骨ECM重塑和轉移前生態位的形成
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主要研究結果
? 成骨細胞、破骨細胞和混合PCa細胞的外泌體特征
PCa細胞系通常分為三組：成骨細胞系、溶骨細胞系和混合細胞系。MDA PCa 2b細胞在植入小鼠脛骨后表現出PCa細胞的成骨細胞表型并誘導成骨。另外兩種PCa細胞系PC3和DU145在骨轉移中誘導溶骨性病變。具有混合表型的PCa細胞系LNCap及其衍生物C4-2/C4-2B可產生混合病變。
因此，研究人員分離了成骨細胞、破骨細胞和混合PCa細胞中的外泌體，并使用TEM和NTA對其進行表征。發現從MDA PCa 2b、C4-2、PC3和LNCap AI+F細胞中分離得到的外泌體均勻，呈卵形，大小大多數分布在~ 90-130 nm范圍內。并通過western blotting檢測外泌體標志物證實了囊泡就是外泌體。此外，PCa細胞和正常前列腺細胞（RWPE-1）之間的外泌體產量存在顯著差異，PCa細胞產生的外泌體比正常前列腺細胞多出約3倍。
??PCa外泌體靶向骨并在體內被骨基質細胞內化
為了闡明PCa外泌體的作用，首先確定PCa外泌體在體內的分布和代謝是至關重要的。因此，研究人員將Vybrant DID標記的外泌體通過尾靜脈注射到小鼠體內。結果顯示體內熒光信號僅在PCa-Exos組的骨骼中觀察到，而在未定位到骨骼的RWPE-1 Exos組中則未觀察到，說明該骨靶點是PCa特異性的。并且PCa-Exos組的平均熒光強度在24和48h顯著升高，在24h達到峰值，然后在48h后急劇下降。以上結果表明，相對于正常外泌體，PCa衍生的外泌體表現出較高的骨特異性靶向傾向。
接下來，為了確定觀察到的熒光是否來自于內化了熒光標記外泌體的細胞。研究人員通過流式細胞術檢測長骨沖出的骨髓細胞熒光信號，發現MDA PCa 2b-Exos組的熒光水平高于Vybrant DID組，表明紅色熒光來自于內化了PCa外泌體的骨髓細胞。為了進一步確定吸收外泌體的骨髓細胞類型，研究人員使用anti-OCN/RANKL/CTSK/TRAP（綠色）對骨骼進行免疫熒光標記。結果顯示標記的外泌體的熒光與來自成骨細胞和破骨細胞的信號（白色箭頭指示）共定位，這證實了尾靜脈注射后PCa外泌體被骨基質細胞內化。
??PCa外泌體被Raw264.7細胞迅速內化并促進體外破骨細胞分化
基于在骨和骨基質細胞中檢測到的PCa外泌體的器官向性，研究人員探索了PCa外泌體是否參與了破骨細胞分化。結果發現100ng/ml RANKL（在破骨細胞分化中起重要作用）培養2天后，再用MDA PCa 2b CM培養48h，Raw264.7細胞（破骨前體細胞，常用于破骨細胞生成）的破骨細胞分化增加，但這種效果被GW4869（一種外泌體抑制劑）逆轉。進一步觀察發現MDA PCa 2b外泌體可被Raw264.7細胞迅速內化。
此外，研究人員使用Raw264.7細胞和BMMs這兩種常用的破骨細胞分化模型進行了一系列的實驗，驗證了成骨細胞、破骨細胞和混合PCa細胞衍生的外泌體均可以誘導破骨細胞分化，無論RANKL是否存在。
??PCa外泌體在體外抑制MC3T3-E1細胞的成骨發生
為了進一步分析觀察到的骨基質細胞外泌體內化，研究人員檢查了MC3T3-E1細胞（一種小鼠成骨前體細胞系，在成骨誘導培養基中可分化成成熟的成骨細胞）的分化，以研究外泌體對成骨細胞的潛在影響。結果發現，在37℃下孵育時，PCa細胞來源的外泌體被MC3T3-E1細胞內化；當細胞在4℃下孵育時，內化受到抑制，這表明受體細胞對外泌體的攝取是一個生物活性過程。接下來，將外泌體與細胞在正常培養基中進行培養，發現成骨細胞標志物Alp、Ocn、Runx2和Osx的mRNA表達均顯著下調，表明MDA PCa 2b外泌體抑制了MC3T3-E1細胞的成骨發生。此外，茜素紅S染色顯示當MC3T3-E1細胞與MDA PCa 2b外泌體在成骨誘導培養基中培養時，細胞的礦化結節形成能力顯著降低。另外，與ALP mRNA表達一致，MDA PCa 2b外泌體培養后，ALP染色降低。進一步表明PCa外泌體可抑制成骨發生。
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??成骨腫瘤來源的外泌體在體內誘導骨溶解
考慮到PCa外泌體在體外骨穩態中的關鍵作用，那么PCa衍生的外泌體是否影響體內骨形成和骨溶解。為了解決這個問題，研究人員將PBS、PCa外泌體或正常外泌體（10ug）通過尾靜脈注射到裸鼠體內，然后采集脛骨進行實驗。micro-CT分析顯示，MDA PCa 2b Exos組右側脛骨的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th顯著低于對照組，而MDA PCa 2b Exos組骨干的BS/BV和Tb.Sp顯著升高。表明經尾靜脈注射MDA PCa 2b外泌體后，骨發生骨溶解。此外，3D重建模型顯示外泌體注射4周后發生脛骨小梁分離。左側脛骨TRAP染色和OCN免疫熒光標記結果顯示MDA PCa 2b Exos組破骨細胞數量增加，成骨細胞數量減少。
注射4周后，改變注射策略，每周注射一次更大劑量的外泌體（50ug），在第42天和第56天采集脛骨并進行micro-CT分析。結果顯示，與對照組和RWPE-1 Exos組相比，MDA PCa 2b Exos組在三個指示時間點均檢測到骨丟失。同樣地，C4-2和PC3外泌體也可誘導骨溶解。這些結果證實了小劑量注射來自成骨、破骨或混合PCa細胞（不借助腫瘤細胞）的PCa外泌體可以顯著誘導模型小鼠的骨溶解并減少骨形成。
??PCa外泌體加速骨腫瘤生長
為了確定PCa外泌體是否能加速骨腫瘤的生長，研究人員在骨髓培養4周后，將慢病毒載體（GFP-Puro-Luc）感染的MDA PCa 2b細胞注射到BALB/C裸鼠右側脛骨，然后在注射后第1天至第56天進行體內成像。結果顯示，直到第49天和第56天，僅在MDA PCa 2b組中可檢測到生物發光，這表明對腫瘤外泌體的預培養加速了骨骼中的腫瘤生長。在第49天和56天，對各組腫瘤負荷進行量化發現這兩個時間點均檢測到生物發光，M-Exos+M-Cells組生物發光強度急劇增加，表明腫瘤細胞的生長被加速了。在第56天處死MDA Exos組小鼠時，micro-CT三維重建圖像檢測到骨腫瘤，H&E染色顯示骨中存在前列腺腫瘤。
??MDA PCa 2b外泌體轉移的miRNA影響骨穩態
接下來，研究人員使用下一代測序技術來分析MDA PCa 2b外泌體中的小RNAs是否會影響骨穩態和腫瘤發展。結果發現與對照組相比，MDA PCa 2b外泌體中有18個miRNAs表達上調，30個miRNAs表達下調。接下來，重點研究了三種特定的miRNAs（miR-92a-1-5p、miR-375和miR-148a-3p）。qPCR分析顯示miR-92a-1-5p、miR-375和miR-148a-3p在MDA PCa 2b外泌體中的表達水平高于RWPE-1外泌體。此外，過表達miR-92a-1-5p可抑制MC3T3-E1細胞的成骨分化，而過表達miR-148a-3p或miR-375促進了成骨分化。
接下來，研究人員對這三個miRNAs的靶基因進行KEGG分析，共鑒定出22條通路?？紤]到這3種miRNAs在骨穩態中的不同作用，選擇了8種潛在的功能通路：RNA降解、細胞外基質（ECM）與受體的相互作用、膀胱癌、p53信號通路、胞吞作用、FOXO信號通路、賴氨酸降解和病毒致癌。結果確定了8個通路中的154個基因作為3個miRNAs的潛在靶基因。為了揭示這些靶基因的潛在功能，研究人員進行了KEGG和GO富集分析。發現這些靶基因在FOXO信號通路、血管生成、外泌體生物合成、細胞增多和癌癥相關通路中富集。表明由PCa外泌體遞送的miRNAs通過多種潛在途徑和靶基因強烈而廣泛地影響骨穩態。
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??MDA PCa 2b外泌體轉移的miR-92a-1-5p通過靶向COL1A1促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞分化
最后，研究人員探索了miR-92a-1-5p（檢測到的最豐富的miRNA）在骨穩態和腫瘤發展中的確切作用。首先，為了確定miR-92a-1-5p在破骨細胞/成骨細胞分化中的作用，使用miRNA mimics或inhibitors轉染Raw264.7細胞/MC3T3-E1細胞，發現miR-92a-1-5p促進破骨細胞分化/抑制成骨細胞分化，anti-miR-92a-1-5p抑制破骨細胞分化/促進成骨細胞分化。接下來，體內實驗顯示Lv-92a-1-5p 組的總腫瘤負荷較高，并且在Lv-92a-1-5p組的骨骼中觀察到腫瘤負荷升高，而前列腺中的腫瘤負荷沒有顯著增加。此外，通過體外成像和PSA免疫熒光標記也證實了腫瘤骨轉移。
為了揭示miR-92a-1-5p調控骨穩態的分子機制，研究人員使用在線miRNA預測軟件鑒定了COL1A1（編碼I型膠原）作為miR-92a-1-5p的靶基因。在轉染miR-92a-1-5p后，COL1A1 mRNA水平在MC3T3-E1細胞中沒有明顯改變，而在Raw264.7細胞中則明顯降低；COL1A1蛋白水平在穩定轉染miR-92a-1-5p的MC3T3-E1和Raw264.7細胞中下降。此外，生物信息學分析及雙熒光素酶報告基因實驗證實了COL1A1是miR-92a-1-5p的直接靶點。MC3T3-E1和Raw264.7細胞中I型膠原表達水平顯著降低進一步證實了以上結果。
為了進一步證明COL1A1敲低在成骨細胞和破骨細胞分化中的作用，研究人員使用Col1a1 siRNA來敲低COL1A1的表達。發現轉染Col1a1 siRNA后Raw264.7細胞中的Ctsk和Trap mRNA表達上調，Trap+破骨細胞數量增加；此外，MC3T3-E1細胞中的Alp和Runx2 mRNA表達下調；ALP染色和ALP活性也降低。
為了檢測MDA PCa 2b細胞的外泌體是否可以在體內降低COL1A1表達，研究人員將MDA PCa 2b外泌體注射到裸鼠體內，每周3次，持續4周，然后收獲脛骨并檢查COL1A1水平。發現COL1A1表達明顯下調。此外，還測量了骨髓培養4周后收獲的脛骨中I型膠原的水平，結果發現MDA PCa 2b治療組的I型膠原標記強度低于對照組。
綜上所述，這些結果表明PCa外泌體來源的miR-92a-1-5p破壞骨穩態，促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞分化，促進PCa腫瘤骨轉移；此外，還揭示了以下潛在機制：miR-92a-1-5p和含有miR-92a-1-5p的MDA PCa外泌體能夠靶向COL1A1并加速骨ECM降解。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12056
本研究中使用到的外泌體Small RNA測序服務、miRNA qPCR引物、miRNA mimic/inhibitor及其NC對照、
轉染試劑盒、COL1A1 siRNA及其NC對照產品均由銳博生物提供！
