肝細胞癌（HCC）是全球第五大常見癌癥，也是癌癥死亡的第二大原因。盡管在診斷、手術技術、靶向治療和免疫治療方面取得了快速進展，但HCC患者的5年總生存率仍然不理想，這主要是由于復發性遠端轉移和對抗腫瘤藥物的耐藥性。HCC腫瘤發生、轉移和耐藥的潛在分子機制仍不清楚。因此，鑒定預后生物標志物，探索HCC腫瘤發生和進展的潛在機制，開發靶向治療手段是至關重要的。
環狀RNAs（circRNAs）是一類由內含子或外顯子通過反向剪接產生的內源性非編碼RNAs。它們具有共價閉合環，無5’端帽和3’端polyA尾。許多研究表明，circRNAs可以充當microRNAs（miRNAs）的海綿或與蛋白質結合，并且circRNA水平的改變會導致基因產物的異常表達。越來越多的研究發現，circRNAs在哺乳動物中廣泛表達，并且在各種癌癥中均有不同程度的表達，例如食管鱗狀細胞癌、尿路上皮癌和結直腸癌。此外，一些circRNAs已被報道參與了HCC的發展，調節細胞增殖、腫瘤轉移和糖酵解。最近的研究闡明了一些circRNA在HCC中的作用。例如，circASAP1通過充當miR-326和miR-532-5p的海綿增強MAPK1和CSF-1的表達，從而促進HCC的生長和肺轉移，而circDLC1通過circDLC1-HuR-MMP1軸抑制HCC的發展和進展，可作為HCC的潛在治療靶點。CircRNA-SORE通過抑制Wnt/β-catenin通路增加HCC細胞對索拉非尼的敏感性。然而，HCC相關的circRNAs是否通過其他調節機制發揮致瘤作用仍有待探索。
N6-甲基腺苷（m6A）修飾作為表觀遺傳調控的一個新領域，具有調節剪接、輸出、蛋白質翻譯、穩定性和腫瘤發生等多種功能，越來越受到人們的關注。m6A RNA甲基化是哺乳動物中最普遍的mRNA內部修飾，由m6A甲基轉移酶（METTL3/14、WTAP、RBM15/15B、KIAA1429、VIRMA和ZC3H13，稱為“writers”）、去甲基化酶（FTO、ALKBH5和ALKBH3，稱為“erasers”）或m6A結合蛋白（YTHDC1/2、YTHDF1/3、IGF2BP1/3、HNRNP和eIF3，稱為“readers”）。其中一些成員（例如METTL3、FTO和IGF2BPs）積極參與各種人類癌癥，如急性淋巴細胞白血病、乳腺癌和子宮內膜癌。m6A和circRNAs之間的橋梁已經被建立。例如，主要定位于細胞質的m6A介導的circRNA可導致mRNA穩定性增強或蛋白質翻譯增加。例如，METTL3依賴性m6A參與了DGCR8介導的miR126和pri-miR126的成熟。在HCC細胞中，KIAA1429可以誘導GATA3的m6A甲基化，促進惡性表型。盡管如此，m6A修飾的circRNAs在HCC中的作用仍需進一步研究。
近年來，基因組研究的顯著進展使基因治療成為一種治療癌癥的新方法。RNA干擾（RNAi）是一種調節靶基因的方法，有望開發出新型分子治療藥物，這些藥物編碼了常規療法不適用的“非藥物”靶標。RNAi分子可分為miRNA、小干擾RNA（siRNA）和短發夾RNA（shRNA）。其中，siRNA由于其強大且特異性的RNAi觸發活性而顯示出巨大的核酸治療潛力。SiRNA是一種短的雙鏈RNAs，能夠使互補信使RNAs（mRNAs）進行序列特異性基因沉默，誘導mRNA降解并抑制靶蛋白的產生。基于siRNA的療法已成為一種有前景的可用于靶向多種疾病的策略。然而，裸露siRNA的基因沉默效率非常低，因為裸露siRNA分子會被血液中的核酸酶迅速降解，并在體內迅速被腎臟清除。此外，siRNA的大尺寸和負電荷阻礙了其滲透到細胞膜并阻止其在細胞內積累。因此，有效的遞送是將siRNA引入到靶細胞和組織的關鍵問題。為了有效地傳遞siRNA，已經開發了各種材料，包括脂質、聚合物、樹枝狀大分子、聚合物膠束和金屬核納米顆粒（NPs）。有趣的是，聚（β-氨基酯）（PAEs）為規避siRNA有效遞送的困難提供了前景。PAEs是一類重要的可生物降解合成聚合物，可被細胞內酯酶降解，從而顯著提高生物相容性?？紤]到它們的pH敏感性、高生物相容性以及用于靈活合成和基因裝載的結構多樣性，它們已被研究用于作為基因和藥物遞送載體以及組織工程支架。
近日，Molecular Cancer（IF27.401）期刊發表了一篇題為M6A-mediated upregulation of circMDK promotes tumorigenesis and acts as a nanotherapeutic target in hepatocellular carcinoma的研究論文。文章報道了一個新型致癌circRNA circMDK，其表達上調與m6A修飾相關，并揭示了其通過miR-346/874-3p-ATG16L1軸促進HCC進展的分子機制。此外，PAEs介導的circMDK siRNA（PAE-siRNA）體內遞送顯著減弱了HCC小鼠模型中的腫瘤進展，暗示circMDK可能作為HCC的潛在生物標志物，并為HCC的治療提供了一種有前途的納米治療策略。
首先，為了研究circRNAs在HCC腫瘤發生中的作用，研究人員對10對HCC和鄰近非癌肝臟（ANL）組織進行RNA-seq分析。結果發現，與ANL組織相比，在HCC中共檢測到92,204個不同的circRNAs，其中4個上調，38個下調。基于失調circRNAs的差異表達水平，研究人員發現hsa_circ_0095868（來源于MDK基因的exon 5，命名為circMDK）顯著上調，HCC組織/細胞中的qRT-PCR實驗進一步證實了這一結果。隨后，研究人員分析了circMDK表達與HCC患者預后之間的關系，結果顯示circMDK表達較高的患者預后較差。此外，研究人員通過Sanger測序、PCR分析、RNase R消化、半衰期分析、核質分離和RNA FISH對circMDK進行了表征，證實了circMDK是豐富的、環狀的、穩定的轉錄本，并且在HCC中顯著上調，主要位于細胞質中。
Fig1. CircMDK表達譜顯示circMDK在HCC中上調
接下來，為了探討circMDK在體外HCC進展中的作用，研究人員使用siRNA和過表達載體進行功能缺失性和獲得性實驗。結果顯示沉默circMDK顯著降低了HCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，增加了HCC細胞的凋亡率；過表達circMDK則產生相反的結果。
Fig2. circMDK在HCC細胞中促進細胞增殖、遷移、侵襲，阻礙細胞凋亡
緊接著，為了探索circMDK是否經歷m6A修飾，研究人員首先使用在線生物信息學工具m6A Avar預測了circMDK中的m6A位點，并在circMDK的exon 5位點發現了一個RRACU m6A序列基序。進一步的研究發現IGF2BP1蛋白是circMDK的m6A結合蛋白，且IGF2BP1在HCC組織中高表達。隨后，研究人員通過RNA pull-down和免疫沉淀實驗證實了circMDK和IGF2BP1的相互作用。此外，circMDK與IGF2BP1的表達呈正相關，IGF2BP1的下調導致circMDK表達降低，且沉默IGF2BP1降低了circMDK的RNA穩定性。表明circMDK的m6A修飾增強了轉錄組穩定性。
Fig3. IGF2BP1識別m6A修飾的circMDK并提高circMDK的轉錄穩定性
機制研究表明，circMDK通過充當miR-346和miR-874-3p的分子海綿來上調miR-346和miR-874-3p共同的靶基因ATG16L1（自噬相關16樣蛋白1），從而激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，最終通過形成的circMDK-mir-346/miR-874-3p-ATG16L1-PI3K/AKT/mTOR信號通路促進細胞增殖、遷移、侵襲并抑制細胞凋亡。
Fig4. circMDK通過mir-346/ 874-3p-ATG16L1軸促進HCC進展的機制示意圖
最后，考慮到circMDK上調在HCC中的關鍵作用，研究人員試圖開發一種靶向circMDK的有效siRNA遞送載體，作為HCC的潛在療法。為此，研究人員合成了PAEs以協助遞送circMDK siRNA（PAE-siRNA）。結果顯示，在包括皮下、轉移、原位和患者源性異種移植（PDX）肝腫瘤模型中，遞送PAE-siRNA有效地抑制了HCC腫瘤進展，且無明顯不良反應。
Fig5. PAE-siRNA復合物在原位模型中的抗腫瘤效果
總之，本研究結果證明了circMDK是一種致癌circRNA，并通過circMDK-miR-346/miR-874-3p-ATG16L1軸在HCC的腫瘤發生和進展中發揮重要作用。本研究首次證明了一種通過靶向circRNA的PAE-siRNA復合物直接有效地抑制HCC的方法，這為HCC提供了一種有前途的納米治療選擇。
原文鏈接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01575-z
本研究使用到的miRNA靶基因3’UTR載體、miRNA mimics和inhibitors、TG16L1 siRNA和circMDK siRNA、5端cy5標記circMDK siRNA、FISH探針、FAM標記miRNA探針等產品均由銳博生物提供！更多circRNA研究產品與服務，歡迎登陸銳博生物官網（www.jyzfjx.com）查看或來電咨詢！
