環狀RNAs（circRNAs）由一大類無5’末端帽和3’末端poly（A）尾的非編碼RNAs組成，它們是由RNA聚合酶II轉錄產生的，通過反向剪接形成共價閉合的RNA環。隨著新一代測序技術的發展，特別是無rRNA測序分析的應用，在真核生物中發現了大量的circRNAs。circRNA剪接過程受到多種因素的調控，包括轉錄延伸率、多個順式或反式調控位點、剪接復合物和順式或反式作用元件。最近的研究表明，這些新型circRNAs在各種生物學過程中發揮著重要作用，如細胞增殖、粘附、凋亡和存活。此外，在心血管疾病、神經系統疾病、代謝綜合征和腫瘤進展中也發現了一些與疾病相關的circRNAs，它們的功能可作為競爭性內源性RNA（ceRNA）充當特定microRNAs海綿、結合蛋白、調節RNA轉錄和剪接，甚至通過翻譯產生多肽。
迄今為止，circRNAs在癌癥研究領域已經引起了廣泛關注。盡管越來越多的研究報道了乳腺癌、肺癌和結直腸癌中的異常circRNAs，但circRNAs在腫瘤細胞中的生物學功能、分子機制和環化模式仍不清楚。有趣的是，circRNAs可以通過病理功能未知的外泌體從癌細胞分泌到循環中。外泌體是由多種細胞產生的30-150nm的細胞外囊泡，其裝載物包括蛋白質、脂質和核酸。迄今為止，已有報道稱，內吞體分選轉運復合體（ESCRT）依賴性和ESCRT非依賴性途徑可以調節外泌體對裝載物進行分選。然而，ESCRT-II復合體可能參與了核酸的外泌體分選過程，miRNAs的特定序列可以決定裝載物是否被分選到外泌體中。與線性RNAs相比，circRNAs更容易分選進入外泌體，但circRNAs的外泌體特異性分選機制仍然完全未知。
circRHOBTB3是通過宿主基因RHOBTB3的剪接和環化產生的。作為Rho GTPase家族的ATPase，宿主基因RHOBTB3參與膜轉運和蛋白酶體降解，可通過促進腎癌中HIF-α的蛋白酶體降解來抑制腫瘤生長。先前的研究還表明circRHOBTB3在卵巢癌、胃癌、CRC和肝細胞癌（HCC）中是一種腫瘤抑制性circRNA。然而，其環化模式和外泌體分泌途徑尚不明確。
反義寡核苷酸（ASO）是8-50 nt的單鏈寡（脫氧）核苷酸或（脫氧）核苷酸類似物，可以人工合成，具有多種化學修飾（例如硫代磷酸酯）。ASOs可以調節RNA的生物合成、蛋白質翻譯、可變剪接以及RNA結合蛋白（RBPs）與RNA的相互作用。隨著技術的進步，這些修飾的ASOs已被應用于治療一些疾病，如巨細胞病毒（CMV）引起的脈絡膜視網膜炎、杜氏肌營養不良癥（DMD）、純合子家族性高膽固醇血癥（HoFH）、急性肝卟啉癥（AHP）和脊髓性肌萎縮癥（SMA）。
近日，Molecular Cancer（IF27.401）期刊發表了題為Tumor-suppressive circRHOBTB3 is excreted out of cells via exosome to sustain colorectal cancer cell fitness的研究論文。闡明了circRHOBTB3在CRC中的抑制作用，提出了一種新的“外泌體逃逸”假說，即腫瘤細胞必須分泌抑制性circRNAs才能維持癌細胞的適應性。此外，還研究了靶向circRHOBTB3環化和外泌體分選元件的特異性ASOs在CRC中的潛在治療效果，這可能成為一種新穎且有前景的抗腫瘤治療靶向策略。
首先，研究人員對公共數據庫中多種癌癥患者（12例CRC患者、21例HCC患者、32例PAAD患者）血清外泌體中的circRNA水平進行了全面分析，結果發現腫瘤患者血清外泌體中存在多種circRNAs差異表達，其中只有circRNA hsa_circ_0007444在所有三種癌癥來源的外泌體中上調，由于hsa_circ_0007444是由RHOBTB3的第6和第7外顯子組成，因此將其命名為circRHOBTB3。隨后，研究人員檢測了18例CRC患者和16例健康對照血清中circRHOBTB3的表達水平，結果顯示CRC患者血清中circRHOBTB3水平高于健康對照，而其在CRC組織中顯著下調，且下調與預后不良有關。
Fig1. CRC中circRHOBTB3的鑒定和表征
接著，研究人員在體外和體內研究了circRHOBTB3在CRC中的功能。體外實驗顯示circRHOBTB3作為一種腫瘤抑制性circRNA發揮作用，敲低circRHOBTB3可促進SW480細胞的遷移和侵襲；體內實驗顯示circRHOBTB3抑制了CRC的生長和轉移。此外，研究人員發現circRHOBTB3被包裹到外泌體中并分泌進入循環中，最終通過泌尿系統排出體外。因此，研究人員推測CRC細胞必須通過外泌體分泌腫瘤抑制性circRHOBTB3來維持癌癥侵襲和轉移的特征。
Fig2. circRHOBTB3在腫瘤細胞外分泌，在體內外抑制CRC細胞
隨后，為了確定circRHOBTB3的下游信號和結合蛋白，研究人員通過RNA-seq、RNA pull-down并結合質譜分析發現circRHOBTB3通過抑制CRC中的代謝途徑和細胞內ROS的產生來發揮腫瘤抑制性circRNA的作用，并且還發現了幾個調節circRHOBTB3環化和外泌體分泌的關鍵元件。此外，研究人員鑒定出SNF8可以將circRHOBTB3分選進入外泌體。有趣的是，研究發現CRC細胞可以比正常細胞主動分泌更多的circRHOBTB3。
Fig3. circRHOBTB3根據其特定的基序序列被分選到外泌體中
之前的研究將circRHOBTB3鑒定為由外泌體分泌到細胞外的腫瘤抑制性circRNA。研究人員想確定通過增加circRHOBTB3環化和減少分泌是否可以成為一種治療策略。因此，反義寡核苷酸（ASOs）被設計用于靶向circRHOBTB3的環化和分泌元件用于CRC治療。根據環化和外泌體分泌的調控元件序列，研究人員設計并合成了ASOs，結果顯示ASOs增加了circRHOBTB3的表達，阻斷了circRHOBTB3的外泌體分泌。更重要的是，ASOs可以在體內抑制CRC的生長和轉移。
Fig4. ASO在體內抑制CRC細胞生長和轉移
總之，本研究結果表明了circRHOBTB3在CRC中發揮腫瘤抑制作用，必須從細胞中排出以維持癌細胞的適應性。ASOs靶向環化和外泌體分泌的調節元件將成為一種新的抗腫瘤策略。
原文鏈接：https://link.springer.com/article/10.1186/s12943-022-01511-1
本研究使用到的動物用ASO、T7生物素體外轉錄試劑盒均由銳博生物提供！
