N6-甲基腺嘌呤（m6A）是最主要的RNA修飾，已被證明與多種癌癥有關。然而，對其在前列腺癌（PCa）中的作用在很大程度上仍然是未知的。近日， Nature子刊Cell Death Discovery期刊上發表了題為METTL14 promotes prostate tumorigenesis by inhibiting THBS1 via an m6A-YTHDF2-dependent mechanism的研究論文。文章報道了METTL14的上調與PCa患者預后不良相關，揭示了METTL14通過m6A-YTHDF2依賴性方式抑制THBS1表達，從而充當癌基因的作用機制。暗示METTL14可能是一個潛在的預后標志物和治療靶點。
作用機制模型示意圖
研究結果：
- METTL14的上調與PCa患者預后不良相關
為了量化PCa患者中METTL14的表達，研究人員對包含前列腺腫瘤組織樣本（n=49）和相鄰正常前列腺組織樣本（n=11）的組織微陣列進行了IHC染色。結果顯示METTL14在PCa組織中高表達。類似地，在人類PCa細胞系中觀察到METTL14 mRNA和蛋白質的高表達水平。此外，研究人員測量了正常和PCa腫瘤細胞系的相對m6A定量。發現PCa腫瘤細胞系表現出比正常細胞更高的m6A水平，并且敲低METTL14可降低PCa細胞系中的m6A水平。
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臨床分析顯示，METTL14高表達的PCa患者表現出更短的總生存期（OS）。隨后，研究人員分析了PCa TCGA數據集，以發現m6A水平與PCa患者預后之間的關聯，結果顯示m6A水平高的患者，其OS較差，提示高m6A水平是不良預后因素。表明METTL14表達上調通過介導m6A修飾影響PCa患者的預后。
METTL14的上調與PCa患者的不良預后相關
- METTL14在體外和體內促進PCa細胞增殖
為了探索METTL14在PCa中的作用，研究人員建立了穩定的METTL14敲低和過表達細胞系。結果發現METTL14的缺失顯著降低了細胞增殖和集落形成效率；而過表達METTL14則會增加腫瘤細胞的增殖和集落數量。此外，細胞周期檢測顯示，METTL14敲低細胞系中，G2期細胞比例增加，S期細胞比例降低；而METTL14表達升高可有效降低G2期細胞比例，并增加S期細胞的比例。進一步證實了METTL14對細胞增殖的作用。體內實驗顯示METTL14的缺失顯著限制了腫瘤的生長。與對照組相比，shMETTL14組的腫瘤體積和重量更小。表明METTL14可導致PCa細胞增殖加速。
METTL14在體外和體內促進PCa細胞增殖
- 通過RNA-seq和MeRIP-seq鑒定METTL14靶標
為了進一步探索METTL14促進腫瘤進展的機制并確定其在PCa中的下游靶標，研究人員使用shNC和shMETTL14 DU145細胞進行了RNA-seq和MeRIP-seq（由銳博生物提供測序服務）。RNA-seq分析顯示， METTL14敲低的腫瘤細胞中分別有204個基因下調，172個基因上調。GO分析發現差異基因與mRNA穩定性調節、細胞周期G2/M相變、結合正調節和RNA轉運有關。
RNA-seq鑒定差異表達基因
MeRIP-seq分析顯示，GGAC是檢測到的peaks峰中最常見的m6A motif?？偟膩碚f，MeRIP-seq分析分別在shNC和shMETTL14細胞中鑒定出5461個和2861個peaks峰。此外，m6A信號在3′ UTR中大量富集。為了評估基因表達的改變是否是由m6A修飾引起的，研究人員將MeRIP-seq中282個減少的m6A峰和RNA-seq中377個改變的基因重疊，發現11個基因都被檢測到。其中內源性血管生成抑制因子THBS1表現出最一致的m6A水平下降，其mRNA水平在shMETTL14 PCa細胞中較對照組升高。因此，選擇THBS1作為METTL14 m6A修飾后的潛在靶基因進行進一步研究。
通過MeRIP-seq鑒定METTL14靶點
- THBS1受METTL14介導的m6A修飾調控
為了驗證THBS1是否是METTL14介導的m6A修飾的靶標，研究人員在PCa細胞中進行了MeRIP-qPCR。結果顯示，METTL14敲低時，THBS1的m6A富集顯著降低。此外，THBS1 mRNA和蛋白質水平在PCa METTL14敲低細胞中均增加。免疫熒光檢測顯示METTL14蛋白定位于細胞核，THBS1蛋白定位于細胞質，敲低METTL14后，PCa細胞中THBS1的表達增加。此外，在用轉錄抑制劑放線菌素D處理培養物后，THBS1 RNA的半衰期在METTL14敲低細胞中得以延長。表明METTL14通過m6A依賴性方式介導mRNA降解以抑制THBS1表達。進一步的研究發現，敲低THBS1導致PCa細胞的生長增加，并且顯著促進腫瘤細胞集落形成能力。表明THBS1可能作為抑制PCa增殖的潛在腫瘤抑制因子。
THBS1受METTL14介導的m6A修飾調控，并在PCa細胞中充當潛在的腫瘤抑制因子
- YTHDF2以m6A依賴性方式促進THBS1 mRNA衰變
m6A writers添加的m6A甲基化需要m6A readers識別以增加或減少基因表達。其中，已知YTHDF2是促進mRNA降解的調節因子，可能被METTL14募集以介導THBS1 mRNA衰變。為了驗證這一猜想，研究人員首先進行了RIP分析，以評估YTHDF2是否可以直接與THBS1 mRNA結合。結果顯示，在PCa細胞中，抗YTHDF2抗體組比抗IgG抗體組結合更多的THBS1 mRNA。當METTL14被抑制時，YTHDF2與THBS1的結合減弱。為了進一步檢查YTHDF2與THBS1 mRNA結合對其表達水平的影響，研究人員使用siRNA敲低YTHDF2，發現THBS1 mRNA和蛋白質表達水平均升高。此外，RNA穩定性分析顯示，敲低YTHDF2后，THBS1的衰減率表現出明顯放緩的趨勢。表明YTHDF2能夠識別METTL14甲基化的THBS1 mRNA，并加速THBS1 mRNA的衰變。
YTHDF2以m6A依賴性方式促進THBS1 mRNA衰變
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41420-022-00939-0
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本研究中使用到的m6A甲基化RNA免疫沉淀試劑盒（貨號：C11051-1）和MeRIP-seq測序服務均由銳博生物提供！更多產品與服務信息，歡迎來電咨詢！
