《Nature Cell Biology》：p53應答lncRNA GUARDIN 對基因組穩定性至關重要

參與DNA損傷應答p53途徑的lncRNAs正在迅速擴大，但lncRNA是否在維持DNA的de novo結構中起作用還尚不清楚。第五屆非編碼RNA和表觀遺傳研究經驗交流會演講嘉賓吳緬教授近期在《Nature Cell Biology》上發表了題為GUARDIN is a p53-responsive long non-coding RNA that is essential for genomic stability的研究成果。該研究揭示了p53應答lncRNA GUARDIN 對于維持基因組完整性至關重要，并且GUARDIN可能成為癌癥治療的潛在靶標。

主要研究結果

1）鑒定p53應答的lncRNA GUARDIN

圖1

該研究通過陣列分析鑒定了一個p53應答的lncRNA GUARDIN。沉默野生型p53會降低GUARDIN表達，過表達p53導致GUARDIN水平增加，而p53突變則不增加GUARDIN水平；此外，p53激活劑引起的DNA損傷可上調GUARDIN，p53轉錄活性小分子抑制劑可減少GUARDIN水平。表明DDR期間的GUARDIN誘導是p53依賴性，野生型p53活性對于GUARDIAN轉錄調控至關重要。

圖2

2）GUARDIN功能研究

圖3

體內和體外功能性實驗顯示：敲降GUARDIN后可顯著抑制細胞增殖，其主要是通過誘導細胞凋亡而導致細胞活力的喪失。表明GUARDIN對細胞存活和增殖至關重要。此外，不存在p53的情況下，敲降GUARDIN不顯著影響細胞活力，但在誘導p53后細胞死亡增強。相反，過表達GUARDIN減少了與p53誘導相關的細胞活力的降低。因此，盡管p53通過調節其表達來控制GUARDIN的功能，但GUARDIN調節了p53的細胞毒性作用。

3）GUARDIN通過螯合miR-23a穩定TRF2

圖4

GUARDIN主要定位于細胞質，暗示其可作為競爭性內源RNA（ceRNA）。miRDB數據庫分析及熒光素酶報告基因實驗顯示GUARDIN與miR-23a相互作用。進一步的實驗顯示體外合成的miR-23a mimics可沉淀內源性GUARDIN；相反，體外合成的GUARDIN與內源性miR-23a有關。此外，miR-23a與GUARDIN反義探針共沉淀。進一步證實了GUARDIN和miR-23a之間的選擇性相互作用。

圖5

TRF2是miR-23a靶標之一。研究發現當敲降/過表達GUARDIN時可上調/下調TRF2以及另一個miR-23a靶標IRF1（干擾素調節因子1）。共同引入anti-miR-23a則消除了GUARDIN敲降對TRF2和IRF1表達的抑制作用。表明GUARDIN通過螯合miR-23a來調節TRF2和IRF1的功能。

4）GUARDIAN對穩定BRCA1至關重要

圖6

質樸分析發現BRCA1可沉淀生物素標記的GUARDIN。Western blotting證實BRCA1與BARD1（BRCA1穩定所必需的BRCA1結合伴侶）一起出現在GUARDIN沉淀物中。此外，GUARDIAN和BARD1一起與BRCA1免疫共沉淀，類似三元復合體，并通過RIP實驗證實了GUARDIAN與BRCA1和BARD1相互作用。

圖7

令人注意的是，GUARDIN缺失導致BRCA1表達的顯著減少，重現了BARD1敲降的效果。此外，敲降GUARDIN增加了BRCA1的多聚泛素化。因此，GUARDIAN對于BRCA1穩定非常重要。

5）GUARDIN可保護基因組完整性

圖8

通過彗星實驗（comet assays）評估GUARDIN對DNA損傷的全面影響，發現敲降GUARDIN會引起尾巴的出現，導致了由阿霉素引起的DNA損傷。此外，敲降GUARDIN會導致端粒融合，組蛋白H2AX（γH2A.X）磷酸化的形成以及與TRF1共定位的p53結合蛋白1（53BP1）的積累。表明需要GUARDIN以保持基因組完整性。

圖9

進一步的研究顯示GUARDIAN在HR和NHEJ中具有重要作用。隨后發現TRF2、anti-miR-23a和BRCA1單獨過表達均未顯著影響由GUARDIN敲降對DDR激活的抑制作用。TRF2和BRCA1的共表達消除了GUARDIN缺失后DDR激活的減少，其可通過共同引入anti-miR-23a和BRCA1表達載體而被重現。因此，TRF2和BRCA1都是GUARDIN介導維持DNA完整性所必需的?？傊?，TRF2過表達或anti-miR-23a和BRCA1過表達的組合對于消除由GUARDIN敲降引起的細胞凋亡和集落形成的抑制是必需的。