表觀遺傳修飾在許多疾病的發生和發展中發揮著重要作用。N6-甲基腺苷（m6A）是最常見和最豐富的RNA修飾之一。越來越多的證據表明，m6A RNA修飾是一個動態且可逆的事件。甲基轉移酶（m6A writers），包括m6A甲基轉移酶樣3（METTL3）、METTL14和WTAP （Wilms腫瘤1相關蛋白），以及去甲基轉移酶（m6A erasers），包括FTO（脂肪量和肥胖相關蛋白）和ALKBH5（alkB同源物5），有助于這種修飾的沉積和去除。m6A修飾可以調節mRNA的剪接、翻譯和衰變速率，從而影響細胞分化、胚胎發育和應激反應等生物學過程。盡管最近的一項研究確定了蛋氨酸-METTL3-m6A軸在多囊腎病中的病理作用，但m6A修飾在腎臟疾病中的作用在很大程度上仍然是未知的。
急性腎損傷（AKI）的定義是腎功能突然下降，并以不受控制的炎癥和程序性細胞死亡為特征。目前缺乏針對AKI的特異性和有效的治療方法。之前的研究發現，FTO的DNA甲基化誘導了PPAR-α（過氧化物酶體增殖物激活受體α）中腺苷的m6A甲基化，從而增加了酒精誘導的腎損傷。最近的一項研究也表明，METTL3在缺血/再灌注（I/R）誘導的AKI模型中被誘導。然而，尚未進行METTL3在體內的功能驗證和潛在機制的分析。
近日，Science Translational Medicine（IF17.956）期刊發表了題為Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms的研究論文。報道了METTL3在不同AKI模型的腎小管以及人體活檢和培養的腎小管上皮細胞（TECs）中均表達升高。揭示了METTL3的遺傳和藥理學抑制通過IGF2BP2依賴性機制減輕TAB3 m6A修飾，從而減輕腎損傷和炎癥的作用機制，暗示METTL3/TAB3軸是治療AKI的潛在靶點。
本研究重點探索了m6A RNA甲基化在AKI中的作用。首先，研究人員使用m6A ELISA實驗發現m6A RNA修飾在順鉑誘導的AKI和單側輸尿管梗阻（UUO）腎病中顯著升高。對甲基轉移酶（METTL3、METTL14和WTAP）和去甲基轉移酶（FTO和ALKBH5）進一步分析發現， METTL3在不同AKI模型的腎小管以及人體活檢和培養的腎小管上皮細胞（TECs）中均表達升高，且這種表達升高是通過c-Jun依賴性機制誘導的。
Fig1. m6A修飾通過c-Jun依賴性機制在人類活檢、小鼠模型和響應促炎刺激的TECs中增加
接下來，研究人員評估了METTL3在HK2細胞中響應炎癥刺激的具體功能。結果顯示，沉默METTL3可減輕TECs在響應TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、順鉑和LPS（脂多糖）刺激下的腎臟炎癥和程序性細胞死亡，而METTL3過表達則具有相反的效果。條件性敲除小鼠腎臟中的METTL3可減輕順鉑和缺血/再灌注（I/R）誘導的腎功能障礙、損傷和炎癥。
Fig2. METTL3增強經促炎刺激處理的HK2細胞的炎癥反應和細胞凋亡
此外，研究人員對單側輸尿管結扎后3天的UUO小鼠腎臟進行了甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）分析。KEGG富集分析表明m6A甲基化與炎癥通路密切相關。為了確定METTL3在腎臟炎癥中的特異性靶標，研究人員對TNF-α刺激的HK2細胞（METTL3沉默or未沉默）進行MeRIP-seq和RNA-seq分析。MeRIP-seq分析顯示，m6A修飾通常位于共有的“RRACH” motif中（R=G或A，H=A、C或U），并且m6A峰在靠近終止密碼子3’非翻譯區（3’UTR）附近尤其豐富。KEGG富集分析表明，炎癥相關信號通路（如TNF-α通路）與METTL3介導的m6A修飾高度相關，進一步支持了METTL3在炎癥中的作用。另外，在METTL3敲低的情況下，TNF-α刺激的HK2細胞中顯示有1211個峰減弱。結合RNA-seq數據分析，研究人員將TAB3 [TGF-β活化激酶1 (MAP3K7) 結合蛋白3] 鑒定為METTL3的靶標。
Fig3. 通過MeRIP-seq和RNA-seq鑒定METTL3靶標
為了進一步驗證METTL3靶向TAB3 mRNA進行m6A修飾，研究人員構建了含有野生型或突變型TAB3的熒光素酶報告基因載體，結果表明TAB3的調節受METTL3相關的m6A修飾的控制。另外，研究人員在METTL3缺陷的HK2細胞中檢測到TAB3 mRNA的半衰期縮短，暗示TAB3的m6A修飾促進其mRNA穩定性。進一步的RIP實驗、Western blot和RNA穩定性分析表明IGF2BP2（胰島素樣生長因子2結合蛋白2）以m6A依賴性方式提高TAB3 mRNA的穩定性。
Fig4. TAB3通過IGF2BP2依賴機制作為METTL3的靶標
接著，研究人員在體外和體內構建了TAB3敲低模型以探索TAB3的功能作用。結果顯示TAB3的破壞通過TAK1/TAB2/NF-κB依賴性機制減弱了TNF-α和順鉑誘導的腎損傷和炎癥反應。
Fig5. 沉默TAB3通過TAK1/TAB2/NF-κB依賴性機制在體外和體內減輕炎癥和細胞凋亡
為了確定METTL3在AKI小鼠模型中的治療潛力，研究人員使用腺相關病毒9（AAV9）包裹的METTL3敲低質粒在小鼠中沉默METTL3。結果顯示AAV9介導的METTL3沉默減輕了順鉑和LPS誘導的AKI小鼠模型中的腎損傷和炎癥。
Fig6. METTL3敲低可減少AKI小鼠模型中的腎臟炎癥和細胞凋亡
最后，研究人員使用混合虛擬篩選策略鑒定了一種METTL3抑制劑Cpd-564，并評估了其腎臟保護和抗酶活性。結果顯示，在從ChemDiv（包含430,000種化合物）和MCE（包含100,000種化合物）中篩選出的前100種化合物中，Cpd-564顯示出最好的腎臟保護作用，并且與先前鑒定的METTL3抑制劑S-腺苷-L-同型半胱氨酸相比，Cpd-564對順鉑和缺血/再灌注誘導的腎損傷和炎癥具有更好的保護作用。
Fig7. METTL3抑制劑Cpd-564在體外和體內通過抑制METTL3介導的TAB3 m6A RNA甲基化來預防細胞損傷和炎癥
總之，本研究結果表明，METTL3表達以c-Jun依賴性方式在響應各種AKI刺激的TECs中被高度誘導，并且METTL3通過增加TAB3 m6A RNA甲基化促進腎臟炎癥和損傷，同時通過IGF2BP2依賴性機制增加TAB3 mRNA的穩定性。該研究工作闡明了目前尚不清楚的m6A有助于AKI的分子機制，并表明靶向METTL3/TAB3軸是一種對抗AKI的潛在策略。
Fig8. METTL3通過IGF2BP2依賴性機制增強TAB3的m6A RNA甲基化和RNA穩定化，從而促進腎損傷和炎癥
原文鏈接：
https://www.science.org/doi/abs/10.1126/scitranslmed.abk2709
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