研究路線

miRNAs的功能失調(diào)已被證實(shí)參與了各種腫瘤的發(fā)展。然而，miRNA是否參與膽囊癌（GBC）的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展尚不清楚。研究人員通過(guò)高內(nèi)涵篩選（HCS）及micrONTM miRNA mimic Library（銳博生物提供）鑒定了一個(gè)可促進(jìn)GBC轉(zhuǎn)移的miR-20a，并進(jìn)一步揭示TGF-β1介導(dǎo)的miR-20a/Smad7/β-catenin軸的激活對(duì)于GBC的發(fā)病機(jī)制及不良預(yù)后具有關(guān)鍵作用，并且可能作為未來(lái)潛在的治療靶標(biāo)。

主要研究結(jié)果

1） 高內(nèi)涵miRNA文庫(kù)篩選鑒定轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs

為了鑒定控制GBC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新型miRNAs，開發(fā)了基于HCS的功能獲得性方法。在880個(gè)miRNAs mimic文庫(kù)中（銳博生物提供），僅篩選出24個(gè)miRNAs作為促轉(zhuǎn)移因子。通過(guò)顯微鏡檢查（細(xì)胞融合度>80％或<30％）驗(yàn)證后確定了17個(gè)miRNAs。隨后，檢測(cè)了前10個(gè)miRNAs的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在GBC腫瘤及正常膽囊組織中均可檢測(cè)到miR-20a和miR-1470，但僅有miR-20a在腫瘤組織中高表達(dá)。與TGF-β1相比，miR-20a顯著增加了F-actin微絲的長(zhǎng)度和厚度。

2） miR-20a在GBC轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用

接著，為了全面了解CASC9功能的分子機(jī)制，研究人員進(jìn)行Microarray分析與機(jī)制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CASC9優(yōu)先影響與ECM-整合素相互作用相關(guān)的基因表達(dá)（fig3f），其中包括整合素通路上游誘導(dǎo)物L(fēng)AMC2。并且證明了LAMC2在ESCC組織中也上調(diào)，可促進(jìn)ESCC轉(zhuǎn)移（fig3CE），LAMC2過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲（fig4B），表明LAMC2在協(xié)調(diào)ESCC轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到與CASC9相似的作用。挽救實(shí)驗(yàn)顯示LAMC2過(guò)表達(dá)部分損害了CASC9敲降導(dǎo)致的細(xì)胞遷移和侵襲能力的下降（fig4C）。表明LAMC2是CASC9誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移活性的主要下游介質(zhì)。

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性miR-20a mimics處理的GBC-SD細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞間接觸減少和更長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)形狀；miR-20a antagomir處理導(dǎo)致形成清晰的紡錘形和多角度細(xì)胞粘附。此外，在miR-20a存在的情況下，GBC-SD細(xì)胞的遷移和侵襲活性增強(qiáng)，但在miR-20a antagomir處理后顯著降低，提示miR-20a可以顯著促進(jìn)體外GBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。另外，miR-20a可顯著增加EMT相關(guān)基因（N-cadherin、Vimentin和Snail）的表達(dá)，同時(shí)降低E-cadherin表達(dá)。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，注射miR-20a antagomir可顯著抑制裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)。IHC染色顯示在miR-20a antagomir注射的腫瘤組織中E-cadherin為膜定位，Vimentin表達(dá)較低和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞較少。隨后構(gòu)建肝臟腫瘤轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)與miR-20a antagomir處理的小鼠相比，對(duì)照小鼠的總轉(zhuǎn)移發(fā)生數(shù)極高。IHC進(jìn)一步證實(shí)存在腫瘤轉(zhuǎn)移。

結(jié)果表明miR-20a在體外和體內(nèi)均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的潛在作用。

3） Smad7是miR-20a的直接靶標(biāo)

為了弄清楚miR-20a誘導(dǎo)GBC增殖和遷移/侵襲的機(jī)制，鑒定了miR-20a潛在的靶基因。發(fā)現(xiàn)Smad7含有與miR-20a互補(bǔ)的保守3’UTR元件。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-20a可以抑制pGLO-Smad7-WT質(zhì)粒而不是pGLO-Smad7-MT的報(bào)告基因活性。此外，miR-20a antagomir或miR-20a mimics處理GBC細(xì)胞導(dǎo)致Smad7 mRNA水平顯著增加或降低。在臨床GBC樣本中也觀察到miR-20a和Smad7之間負(fù)相關(guān)。

結(jié)果表明miR-20a在體外和體內(nèi)均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的潛在作用。

4） miR-20a對(duì)Smad7表達(dá)的負(fù)調(diào)控對(duì)miR-20a促進(jìn)GBC細(xì)胞轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化至關(guān)重要

Smad7是否負(fù)責(zé)miR-20a介導(dǎo)的GBC-SD細(xì)胞的惡性表型？為了解決這個(gè)問(wèn)題，在存在或不存在Smad7表達(dá)的情況下檢測(cè)了miR-20a對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。發(fā)現(xiàn)外源性Smad7的表達(dá)阻斷了大部分miR-20a誘導(dǎo)的遷移/侵襲和增殖。Western blot分析證明Smad7可以逆轉(zhuǎn)由miR-20a促進(jìn)的E-cadherin下調(diào)和Vimentin上調(diào)。表明Smad7負(fù)調(diào)控GBC細(xì)胞轉(zhuǎn)移和EMT表型，這對(duì)GBC發(fā)病過(guò)程中miR-20a的促轉(zhuǎn)移能力是必需的。

5） 減少Smad7導(dǎo)致β-catenin信號(hào)的核轉(zhuǎn)位和反式激活

Smad7是否通過(guò)螯合β-catenin的核轉(zhuǎn)位來(lái)抑制miR-20a活性？通過(guò)雙報(bào)告基因系統(tǒng)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Western blot發(fā)現(xiàn)miR-20a表達(dá)的GBC-SD細(xì)胞系中β-catenin更多位于核中，且β-catenin信號(hào)活性顯著增加；但Smad7過(guò)表達(dá)可消除miR-20a誘導(dǎo)的β-catenin核積累，并消除了miR-20a增強(qiáng)的β-catenin報(bào)告基因活性。表明β-catenin的核質(zhì)轉(zhuǎn)位是miR-20a/Smad-7軸操縱GBC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的原因。

6） miR-20a表達(dá)升高與GBC的不良預(yù)后相關(guān)

臨床研究發(fā)現(xiàn)miR-20a高表達(dá)的患者表現(xiàn)出更差的OS，GBCs中Smad7的減少也預(yù)示預(yù)后不良。此外，miR-20a升高和Smad7水平降低的患者預(yù)后甚至更差，表明兩種因素的組合提供了更高的預(yù)后準(zhǔn)確性。此外，單因素/多因素Cox回歸分析證實(shí)miR-20a和Smad7是總生存期的獨(dú)立指示因子。進(jìn)一步表明了miR-20a/Smad7/β-catenin軸在GBC的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，其活性可作為臨床上GBC復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的預(yù)測(cè)標(biāo)記。

7） miR-20a表達(dá)升高對(duì)于TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移是必需的

TGF-β1作為癌癥中炎癥和轉(zhuǎn)移相關(guān)的最有效細(xì)胞因子之一，其是否參與GBC的發(fā)病機(jī)制和miR-20a誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移？ELISA實(shí)驗(yàn)及IHC發(fā)現(xiàn)GBC患者血清或腫瘤組織中的TGF-β1顯著增加。有趣的是，在大多數(shù)腫瘤組織中TGF-β1的表達(dá)與miR-20a正相關(guān)，TGF-β1處理GBC細(xì)胞后導(dǎo)致miR-20a水平增加；miR-20a antagomir處理GBC細(xì)胞則減弱了TGF-β1增強(qiáng)的細(xì)胞遷移和侵襲。

本研究表明miR-20a/Smad7/β-catenin軸在TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，其為膽囊癌提供了潛在的預(yù)后標(biāo)志物和有價(jià)值的治療靶標(biāo)。