研究路線

miRNAs的功能失調已被證實參與了各種腫瘤的發展。然而，miRNA是否參與膽囊癌（GBC）的轉移和進展尚不清楚。研究人員通過高內涵篩選（HCS）及micrONTM miRNA mimic Library（銳博生物提供）鑒定了一個可促進GBC轉移的miR-20a，并進一步揭示TGF-β1介導的miR-20a/Smad7/β-catenin軸的激活對于GBC的發病機制及不良預后具有關鍵作用，并且可能作為未來潛在的治療靶標。

主要研究結果

1） 高內涵miRNA文庫篩選鑒定轉移相關的miRNAs

為了鑒定控制GBC細胞轉移的新型miRNAs，開發了基于HCS的功能獲得性方法。在880個miRNAs mimic文庫中（銳博生物提供），僅篩選出24個miRNAs作為促轉移因子。通過顯微鏡檢查（細胞融合度>80％或<30％）驗證后確定了17個miRNAs。隨后，檢測了前10個miRNAs的表達，并發現在GBC腫瘤及正常膽囊組織中均可檢測到miR-20a和miR-1470，但僅有miR-20a在腫瘤組織中高表達。與TGF-β1相比，miR-20a顯著增加了F-actin微絲的長度和厚度。

2） miR-20a在GBC轉移和生長中起著關鍵作用

接著，為了全面了解CASC9功能的分子機制，研究人員進行Microarray分析與機制實驗發現CASC9優先影響與ECM-整合素相互作用相關的基因表達（fig3f），其中包括整合素通路上游誘導物LAMC2。并且證明了LAMC2在ESCC組織中也上調，可促進ESCC轉移（fig3CE），LAMC2過表達可增強細胞的遷移和侵襲（fig4B），表明LAMC2在協調ESCC轉移過程中起到與CASC9相似的作用。挽救實驗顯示LAMC2過表達部分損害了CASC9敲降導致的細胞遷移和侵襲能力的下降（fig4C）。表明LAMC2是CASC9誘導的轉移活性的主要下游介質。

體外實驗發現外源性miR-20a mimics處理的GBC-SD細胞表現出細胞間接觸減少和更長的形態學形狀；miR-20a antagomir處理導致形成清晰的紡錘形和多角度細胞粘附。此外，在miR-20a存在的情況下，GBC-SD細胞的遷移和侵襲活性增強，但在miR-20a antagomir處理后顯著降低，提示miR-20a可以顯著促進體外GBC細胞的轉移。另外，miR-20a可顯著增加EMT相關基因（N-cadherin、Vimentin和Snail）的表達，同時降低E-cadherin表達。

體內實驗顯示，注射miR-20a antagomir可顯著抑制裸鼠的腫瘤生長。IHC染色顯示在miR-20a antagomir注射的腫瘤組織中E-cadherin為膜定位，Vimentin表達較低和Ki-67陽性細胞較少。隨后構建肝臟腫瘤轉移模型，發現與miR-20a antagomir處理的小鼠相比，對照小鼠的總轉移發生數極高。IHC進一步證實存在腫瘤轉移。

結果表明miR-20a在體外和體內均具有促進細胞增殖和轉移的潛在作用。

3） Smad7是miR-20a的直接靶標

為了弄清楚miR-20a誘導GBC增殖和遷移/侵襲的機制，鑒定了miR-20a潛在的靶基因。發現Smad7含有與miR-20a互補的保守3’UTR元件。熒光素酶報告基因實驗顯示miR-20a可以抑制pGLO-Smad7-WT質粒而不是pGLO-Smad7-MT的報告基因活性。此外，miR-20a antagomir或miR-20a mimics處理GBC細胞導致Smad7 mRNA水平顯著增加或降低。在臨床GBC樣本中也觀察到miR-20a和Smad7之間負相關。

結果表明miR-20a在體外和體內均具有促進細胞增殖和轉移的潛在作用。

4） miR-20a對Smad7表達的負調控對miR-20a促進GBC細胞轉移和上皮-間質轉化至關重要

Smad7是否負責miR-20a介導的GBC-SD細胞的惡性表型？為了解決這個問題，在存在或不存在Smad7表達的情況下檢測了miR-20a對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。發現外源性Smad7的表達阻斷了大部分miR-20a誘導的遷移/侵襲和增殖。Western blot分析證明Smad7可以逆轉由miR-20a促進的E-cadherin下調和Vimentin上調。表明Smad7負調控GBC細胞轉移和EMT表型，這對GBC發病過程中miR-20a的促轉移能力是必需的。

5） 減少Smad7導致β-catenin信號的核轉位和反式激活

Smad7是否通過螯合β-catenin的核轉位來抑制miR-20a活性？通過雙報告基因系統、免疫熒光實驗和Western blot發現miR-20a表達的GBC-SD細胞系中β-catenin更多位于核中，且β-catenin信號活性顯著增加；但Smad7過表達可消除miR-20a誘導的β-catenin核積累，并消除了miR-20a增強的β-catenin報告基因活性。表明β-catenin的核質轉位是miR-20a/Smad-7軸操縱GBC細胞轉移的原因。

6） miR-20a表達升高與GBC的不良預后相關

臨床研究發現miR-20a高表達的患者表現出更差的OS，GBCs中Smad7的減少也預示預后不良。此外，miR-20a升高和Smad7水平降低的患者預后甚至更差，表明兩種因素的組合提供了更高的預后準確性。此外，單因素/多因素Cox回歸分析證實miR-20a和Smad7是總生存期的獨立指示因子。進一步表明了miR-20a/Smad7/β-catenin軸在GBC的發展中起關鍵作用，其活性可作為臨床上GBC復發和預后不良的預測標記。

7） miR-20a表達升高對于TGF-β1誘導的細胞轉移是必需的

TGF-β1作為癌癥中炎癥和轉移相關的最有效細胞因子之一，其是否參與GBC的發病機制和miR-20a誘導的腫瘤轉移？ELISA實驗及IHC發現GBC患者血清或腫瘤組織中的TGF-β1顯著增加。有趣的是，在大多數腫瘤組織中TGF-β1的表達與miR-20a正相關，TGF-β1處理GBC細胞后導致miR-20a水平增加；miR-20a antagomir處理GBC細胞則減弱了TGF-β1增強的細胞遷移和侵襲。

本研究表明miR-20a/Smad7/β-catenin軸在TGF-β1誘導的腫瘤轉移中起著關鍵作用，其為膽囊癌提供了潛在的預后標志物和有價值的治療靶標。