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載體構建即是構建含外源DNA的質粒，根據不同的載體骨架及實驗目的，銳博生物可提供多種類型的高品質載體構建服務。主要包括：miRNA靶基因3’UTR報告基因載體、lncRNA/基因過表達載體、circRNA過表達載體、shRNA載體、miRNA Sensor報告基因載體、啟動子報告基因載體、信號通路報告基因載體等
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2021年10月31日前，凡是在銳博生物在線平臺（www.jyzfjx.com）提交以上任一載體構建服務即可享受75折特惠促銷價，僅剩最后5天，
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miRNA靶基因3’UTR報告基因載體
pmiR-RB-ReportTM載體圖譜
銳博生物可以根據客戶需求定制任何基因的3’UTR雙熒光素載體。2021年10月31日前，凡是在銳博生物在線平臺（www.jyzfjx.com）提交載體構建服務即可享受75折特惠促銷價，有需求的各位小伙伴趕緊入手吧?。?strong>*由于構建難度和實驗難度隨著基因3’UTR長度的增加而顯著升高，建議構建長度不超過2.5kb）
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委托服務/下單鏈接：http://www.jyzfjx.com/product-and-service/carrier-construction/mirna-3utr/
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應用案例：
Xie Y, et al.?The Journal of clinical investigation, 2021.
Zhou C, et al.?Molecular Therapy, 2021.
lncRNA/基因過表達載體
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通過lncRNA/基因過表達載體進行功能獲得性實驗（gain-of-function）是研究基因功能的重要手段，與以RNAi為代表的功能缺失性實驗（loss-of-function）相互補充以驗證lncRNA/基因在相關細胞功能中的作用。銳博生物pEXP-RB-Mam系列過表達載體，在多克隆位點上游有CMV強啟動子，可高效地表達插入到多克隆位點中的lncRNA/基因。
pEXP-RB-Mam系列載體圖譜
主要元件：
CMV promoter：CMV啟動子,可啟動插入至多克隆位點處的基因的轉錄；
AmpR：氨芐青霉素抗性基因，用于含質粒宿主菌篩選；
NeoR：新霉素抗性基因，用于G418等抗生素篩選轉染成功的哺乳動物細胞；
EGFP：增強型綠色熒光蛋白，可用熒光顯微鏡等熒光檢測系統或流式細胞儀等檢測轉染成功的哺乳動物細胞；
RFP：紅色熒光蛋白，可用熒光顯微鏡等熒光檢測系統或流式細胞儀等檢測轉染成功的哺乳動物細胞。
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應用案例：
以GAPDH作為內參，選用293T、A549、Hela細胞作為過表達對象，構建好的lncRNA1、2、3過表達載體分別在這3種細胞內過表達，qRT-PCR驗證結果如圖所示：
LncRNA1、2、3過表達載體分別在293T、A549 和Hela細胞內過表達的qRT-PCR驗證結果圖
circRNA過表達載體
環狀RNA（circRNA）是一種閉環的單鏈RNA分子，在細胞中發揮著多種重要作用，如調控轉錄，或者以ceRNA的方式調控miRNA的活性等等。pCE-RB-Mam環狀RNA過表達載體，多克隆位點兩翼高效促進RNA成環剪切的反向重復序列可使插入到多克隆位點中的序列轉錄后成環剪切，從而實現circRNA的過表達。
pCE-RB-Mam載體圖譜
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應用案例：
將circEYA3過表達載體和對照載體穩定轉染后，采用qRT-PCR分析MiaPaCa-2細胞中circEYA3和EYA3 mRNA的水平。
結果顯示重組circEYA3質粒成功穩定過表達circEYA3，且EYA3 mRNA水平無明顯變化。
Rong Z, et al.?Molecular Cancer, 2021.
通過qRT-PCR檢測空載體和circ_0018414過表達載體轉染的A549和SPC-A1細胞中circ_0018414的表達。
結果顯示兩個細胞中的circ_0018414均穩定過表達。
Yao Y, et al.?Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2021.
shRNA載體
Short hairpin RNA（shRNA）是化學合成siRNA之外的另一種RNAi實驗方法常用工具。銳博生物shRNA載體骨架為pRNAT-U6.1/Neo，轉染細胞后，shRNA在U6啟動子的調控下表達，并最終剪切形成siRNA duplex起作用。載體上另外GFP標簽，可用于檢測確認質粒的轉染情況。
服務流程：
a. 客戶提供靶基因Gene ID或shRNA序列，并與銳博生物簽訂服務合同；
b. shRNA載體構建周期約25個工作日；
c. 銳博生物提供shRNA質粒載體10μg及實驗報告書。
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應用案例：
構建CCL5特異性shRNA載體及shNT載體，然后轉導進周細胞，發現與對照相比，shRNAs（shCCL5-1 or shCCL5-2）破壞了周細胞中CCL5的表達，并顯著降低了周細胞CM的保護作用。
Zhang X N, et al.?Cell Research, 2021.
將構建的Fosl1特異性shRNA及其NC克隆到AAV9-shRNA表達質粒以生成AAV9-shFosl1和AAV9-shNC，然后通過皮下注射到新生小鼠體內。結果顯示，新生小鼠心臟中的Fosl1表達顯著降低，并且Fosl1沉默顯著抑制了CMs的細胞周期進入。
Wu H Y, et al.?NPJ Regenerative Medicine, 2021.
miRNA Sensor報告基因載體
miRNA Sensor報告基因載體主要用于檢測細胞內目標miRNA的活性變化，譬如內源競爭性RNA（ceRNA）對miRNA活性的影響。
銳博生物miRNA Sensor報告基因載體以pmiR-RB-Report?載體骨架為基礎，將目標miRNA的結合序列克隆至海腎螢光素酶基因（hRluc）下游，目標miRNA可通過該結合序列調控海腎螢光素酶的表達，故可以海腎螢光素酶基因作為報告基因，以螢火蟲螢光素酶基因（hLuc）作為內參基因，通過檢測海腎螢光素酶活性的相對變化情況來判斷細胞內miRNA的活性變化，如可以調控miRNA的ceRNA高表達，則miRNA被ceRNA結合，活性下降，海腎螢光素酶的相對活性上升。
miRNA Sensor報告基因載體圖譜
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應用案例：
啟動子報告基因載體
轉錄因子與啟動子的結合是基因轉錄調控的重要事件，啟動子報告基因載體可用于檢測特定轉錄因子通過啟動子上特定位點調控基因轉錄的檢測。
銳博生物pPro-RB-Report載體通過在海腎螢光素酶基因上游多克隆位點插入目的基因的啟動子，以海腎螢光素酶基因作為報告基因，以螢火蟲螢光素酶基因作為內參基因，通過檢測海腎螢光素酶活性的相對變化情況來確定該段啟動子的轉錄活性以及轉錄因子通過該段啟動子特定位點調控基因表達的活性。
pPro-RB-Report載體圖譜
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信號通路報告基因載體
TGF-β(transforming growth factor beta，轉化生長因子β）在多種細胞中影響細胞的生長、分化、周期調控、免疫反應等，從而與個體的發育、腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病等都有緊密的聯系。一般情況下，TGF-β與胞膜外側的受體結合后可誘導產生一系列信號級聯放大從而磷酸化并激活SMAD2和SMAD3，磷酸化的SMAD2和SMAD3與SMAD4結合后一起被轉運入核，該活化的SMAD復合物與DNA上的SBE（SMAD binding element）結合后可促進相關下游基因的轉錄。
pREL-RB-TGF-β信號通路報告基因載體的hRluc（Renilla Luciferase）上游，由含有多個SBE及minP的序列組成，當TGF-β/SMAD信號通路活化時，可促進hRluc的表達。故通過檢測hRluc產生的螢光信號，即可反應TGF-β/SMAD信號通路的活化情況。
pREL-RB-TGF-β信號通路報告基因載體圖譜
主要元件：
hRluc：海腎螢光素酶基因，為報告基因；
luciferase：螢火蟲螢光素酶基因，可作為參照基因；
multimerized SBE：多重SMAD結合元件，活化的SMAD結合位點；
pause site：轉錄中止信號，減少上游基因轉錄對hRluc轉錄的影響。
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客戶代表性文章
[1] Zhang X N, Yang K D, Chen C, et al. Pericytes augment glioblastoma cell resistance to temozolomide through CCL5-CCR5 paracrine signaling[J].?Cell Research, 2021: 1-16.
[2] Rong Z, Shi S, Tan Z, et al. Circular RNA CircEYA3 induces energy production to promote pancreatic ductal adenocarcinoma progression through the miR-1294/c-Myc axis[J].?Molecular Cancer, 2021, 20(1): 1-19.
[3] Wu H Y, Zhou Y M, Liao Z Q, et al. Fosl1 is vital to heart regeneration upon apex resection in adult Xenopus tropicalis[J].?NPJ Regenerative Medicine, 2021, 6(1): 1-16.
[4] Xie Y, Zhang X, Xu P, et al. Aberrant oligodendroglial LDL receptor orchestrates demyelination in chronic cerebral ischemia[J].?The Journal of clinical investigation, 2021, 131(1).
[5] Zhou C, Wei W, Ma J, et al. Cancer-secreted exosomal miR-1468-5p promotes tumor immune escape via the immunosuppressive reprogramming of lymphatic vessels[J].?Molecular Therapy, 2021, 29(4): 1512-1528.
[6] Yao Y, Zhou Y, Hua Q. circRNA hsa_circ_0018414 inhibits the progression of LUAD by sponging miR-6807-3p and upregulating DKK1[J].?Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2021, 23: 783-796.
[7] Zhou R, Shi L, Shan K, et al. Circular RNA-ZBTB44 regulates the development of choroidal neovascularization[J].?Theranostics, 2020, 10(7): 3293.
[8] Liu Y, Liu H, Li Y, et al. Circular RNA SAMD4A controls adipogenesis in obesity through the miR-138-5p/EZH2 axis[J].?Theranostics, 2020, 10(10): 4705.
[9] Lin J, Liu Z, Liao S, et al. Elevation of long non-coding RNA GAS5 and knockdown of microRNA-21 up-regulate RECK expression to enhance esophageal squamous cell carcinoma cell radio-sensitivity after radiotherapy[J].?Genomics, 2020, 112(3): 2173-2185.
[10] Li J, Li P, Zhang G, et al. CircRNA TADA2A relieves idiopathic pulmonary fibrosis by inhibiting proliferation and activation of fibroblasts[J].?Cell death & disease, 2020, 11(7): 1-15.
