基于siRNA的高通量篩選鑒定影響自噬的lncRNAs
首先，研究人員針對肺癌、肝癌或乳腺癌中638個上調的lncRNAs制備siRNA文庫，轉染細胞后，通過高內涵成像和自動化定量分析，鑒定了63個lncRNAs轉錄本在敲低后會影響GFP-LC3B斑點的數量，暗示可能參與自噬的調控。然后根據基因注釋、外顯子-內含子結構和基因組位置，研究人員選取14個候選lncRNAs（6個下調，8個上調）進行驗證篩選，發現轉錄本uc002asg.1（lncRNA DRAIC）的敲低最顯著地減少了GFP-LC3B斑點陽性細胞數量。
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DRAIC的定位，表達和自噬非依賴性
通過數據庫分析和核質分離證實DRAIC在MCF-7細胞中是細胞質和細胞核定位，并且Torin1處理誘導的自噬不會改變DRAIC的細胞定位。此外，研究發現DRAIC在乳腺癌中高表達，而自噬并不影響其表達水平，表明DRAIC是自噬非依賴性的。
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DRAIC敲低減少了自噬體數量和LC3B蛋白水平
研究人員通過透射電子顯微鏡法觀察和量化了DRAIC敲低后成熟自噬體的數目，結果發現自噬體超微結構沒有明顯變化，但自噬體的數量更少。GFP-LC3B斑點和自噬體的減少是否與較低水平的LC3B蛋白相關呢？Western blot結果顯示，DRAIC敲低使得GFP融合和內源性LC3B (I和II)的表達均降低，但LC3B和GFP-LC3B mRNA水平保持穩定。過表達DRAIC則明顯增加了LC3B蛋白水平。
DRAIC敲低增加了自噬潮并作用于mTOR途徑
由于自噬是一個動態的過程，自噬體數量的減少和LC3B蛋白水平的降低可以說明兩種不同的情況。要么自噬誘導減少，表現為PE結合的LC3B (LC3B-II)較少，要么自噬潮增加，以至于大部分LC3B-II被溶酶體降解。研究人員發現DRAIC的缺失降低了自噬受體p62的蛋白水平，而p62是一種自噬貨物，它被摻入自噬體并在自噬體中降解。因此，DRAIC敲低后導致的p62減少表明了自噬潮的增加。
為了進一步研究DRAIC對自噬潮的影響，研究人員通過CRISPR-Cas9技術構建了ATG5和ATG7敲除的MCF-7細胞，發現在這些敲除細胞系中敲低DRAIC對LC3B-I的作用已基本消除，這表明DRAIC介導的LC3B調控需要ATG5和ATG7依賴性自噬潮。
由于mTORC1復合物是自噬途徑的關鍵上游調節因子之一，那么DRAIC是否也會影響mTORC1信號傳導呢。實驗發現DRAIC缺失會導致mTOR激酶的直接靶點ULK1的Ser757磷酸化減少以及p70S6激酶的Thr389磷酸化水平明顯下降。
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總之，這些結果表明在缺乏DRAIC的情況下，mTORC1下游的信號傳導減少，自噬潮增加。
DRAIC敲低影響細胞周期進程
研究人員除了對GFP-LC3B斑點進行定量分析外，還對每個siRNA轉染過程中的細胞活力進行了測量，發現DRAIC的敲低會導致細胞計數下降。為了了解DRAIC對細胞活力的影響及其與自噬表型的可能聯系，研究人員對DRAIC缺失的MCF-7細胞進行了RNA測序。基因集富集分析發現在DRAIC敲低后下調的基因中，E2F靶基因和G2M檢查點基因富集比例最高。
流式分析顯示DRAIC缺失的細胞在G1期(76.8和83.2%)積累，S期檢測到的細胞較少。
通過western blotting進一步分析DRAIC對細胞周期調節因子的影響，發現DRAIC敲低導致p53及其下游靶點p21上調，導致細胞周期蛋白A、E2和D1減少，并且降低了Rb在S608和S795位點的磷酸化。表明DRAIC與細胞周期從G1期向S期過渡有關。
DRAIC以自噬非依賴性方式對細胞增殖至關重要
研究發現DRAIC的缺失導致細胞增殖率下降，而過表達DRAIC導致細胞增殖速度加快，證實了DRAIC與增殖有關。為了進一步探索增殖缺陷是否與自噬有關，研究人員將ATG5和ATG7敲除細胞系中的DRAIC的敲低，并監測其生長，結果發現自噬缺陷細胞也表現出同樣的增殖缺陷。表明DRAIC以自噬非依賴性方式對細胞增殖至關重要。
總之，目前的高通量高內涵siRNA文庫篩選為研究lncRNAs在自噬中的功能提供了有價值的資源。在此基礎上，本研究鑒定了lncRNA DRAIC是乳腺癌細胞自噬的一種新的調節因子。深入了解了lncRNAs與自噬之間的相互依賴關系，可能在不久的將來就可以推動臨床治療的發展。
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原文：Tiessen I, Abildgaard M H, Lubas M, et al. A high-throughput screen identifies the long non-coding RNA DRAIC as a regulator of autophagy[J]. Oncogene, 2019, 38(26): 5127-5141.
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